杨中铎，东建丽,赵维花

(兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州　730050)



药用植物内生真菌分离及其次级代谢产物生物活性研究

杨中铎，东建丽,赵维花

(兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050)

为分离药用植物中内生真菌，从次级代谢产物中筛选对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶有较高抑制率的提取物.用分块法分离5种植物，马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基纯化内生真菌，液体培养基发酵，用乙酸乙酯萃取菌液，甲醇提取菌丝体，用酶标法检测提取物对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶的抑制率.共分离得到45株菌，制备了90种提取物，其中5株菌的菌液提取物对单胺氧化酶有不同程度的抑制率，露蕊乌头39(LRWT-39)的菌液提取物对单胺氧化酶的抑制率最高，所有提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率不高.表明药用植物内生真菌中存在抗单胺氧化酶的活性成分，值得进一步研究.

内生真菌;单胺氧化酶;乙酰胆碱酯酶;次级代谢产物

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE),是一个含有537个氨基酸的蛋白，通向酶活性中心的是一个细长、下端扩展的通道，也称“芳香峡谷”[1].它是通过减少突触间隙乙酰胆碱降解、增加突触间乙酰胆碱的可利用性，来治疗阿尔兹海默症.单胺氧化酶(Monoamine oxidase，MAO)是机体内参与胺类代谢的主要酶类，其活性高低与多种疾病如阿尔兹海默症、抑郁症、衰老等密切相关[2-3]，目前用抑制单胺氧化酶活性的方法治疗这些疾病.但所用的抗乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的药物毒副作用大，所以寻找新药刻不容缓.近年来，有关与植物有互利共生关系的植物内生真菌的研究越来越热门，它们产生的活性物质在生物防治和医药领域有巨大的应用潜力[4]，有关内生真菌在医学领域的报道主要与抗菌、抗肿瘤、抗氧化活性类物质和免疫活性物质相关[5].

内生真菌是生活在健康植物组织内部且不引起植物产生明显病症的一类真菌.这类真菌生长在植物体的特殊环境中，不但可以促进宿主植物的生长发育，而且自身能产生许多活性物质，包括一些结构新颖的化合物[6].当前国内外对植物内生真菌的研究还处于初级阶段，所研究的植物对于庞大的内生真菌来说是一小部分，我国对内生真菌的研究比较晚，主要是菌的分离及生物活性研究[7].为了寻找具有抑制乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的活性物质，本文对露蕊乌头(Aconitum gymnandrum Maxim)、紫堇(Corydalis edulis Maxim)、翠雀(Delphinium grandiflorum)、高乌头(Aconitum sinomontanum Nakai)、甘青乌头(Aconitum tanguticum(Maxim)Stapf)5种植物的内生真菌进行分离，并检测其次级代谢产物对乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的抑制率，旨在为治疗阿尔兹海默症和抑郁症寻找有效而副作用少的新药奠定基础.

1　材料与方法

1.1药材

露蕊乌头、翠雀、高乌头、紫堇、甘青乌头采自甘南草原，标本由兰州理工大学生命科学与工程学院杨林副教授鉴定.Wistar雌鼠购自兰州大学实验动物中心.

1.2试剂与仪器

pH=7.6，7.0,8.0磷酸盐缓冲溶液(PBS)；磷酸异丙烟肼(东京化工有限公司)、碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)、5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、乙酰胆碱酯酶(AChE，百灵威科技有限公司)、石杉碱甲(Huperzine -A)、4-氨基安替吡啉、辣根过氧化物酶、4-(三氟甲基)苄胺、香草酸(阿拉丁试剂公司).

博迅SPX-100B-Z生化培养箱(上海博迅实业有限公司)、SHZ-82型恒温振荡培养箱(江苏省荣华仪器制造有限公司)、酶标分析仪DNM-9602、旋转蒸发仪RE-52(上海亚荣生化仪器厂).

1.3培养基

分离和纯化培养基：PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基+硫酸链霉素(200 mg·L-1).PDA培养基配法：马铃薯200 g·L-1，葡萄糖0.2 g·L-1，琼脂0.2 g·L-1.

1.4样品制备

1.4.1内生真菌的分离和纯化取5种新鲜植物的花、叶、根、茎，用蒸馏水浸泡冲洗，用剪刀将叶片剪成0.8 cm×0.5 cm的碎片，其他部位剪成0.6 cm×0.7 cm×0.8 cm的长方体.在超净工作台中无菌通风条件下，将剪好的植物用医用酒精分别消毒3，4，5 min 3个梯度,无菌水洗3次，然后再分别用0.1%的升汞溶液消毒30 s，无菌水冲洗3次，放入分离PDA培养基中，每块培养基中接3～4块药材.最后一次表面消毒的无菌水用涂布法涂于PDA培养基上，将所有培养皿置于28 ℃培养箱中培养5～7 d.观察用涂布法涂的培养皿是否有细菌生长.将药材剖面处长出的菌在PDA培养基上进行纯化，得到颜色、形态、大小不一样的内生真菌，将其编号后转存于PDA斜面培养基上，让菌株在28 ℃恒温培养箱中生长3～5 d，最后在4 ℃冰箱中冷冻保存.

1.4.2次生代谢物粗提物的制备冻存的菌株用PDA纯化培养基活化，接种于液体培养基中，28 ℃ 180 r·min-1条件下培养17 d，用布氏漏斗抽滤培养后的菌株，用等体积的乙酸乙酯萃取滤液2次；用甲醇回流提取菌丝体2～3 h，分别提取2次.减压蒸馏得到菌液有机相和菌丝体醇提取组分，称取1～1.5 mg样品用50 μL无水乙醇溶解，PBS缓冲液配制成1 mg·mL-1的溶液.

1.5单胺氧化酶活性检测

1.5.1单胺氧化酶的制备将雌性Wistar 大鼠(280～300 g)颈椎脱臼处死，取肝脏，用0.2 mol pH=7.6磷酸缓冲液洗涤.在冰浴中将肝剪碎，用0.3 mol·L-1蔗糖溶液(W/V)1∶10匀浆，然后离心.先用1 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，用蔗糖溶液配平，1 200 r·min-1离心15 min，取上清液，10 000 r·min-1离心30 min，弃去上清液，用4 mL磷酸钠盐缓冲液溶解沉淀，每400 μL分装.经过酶活力的测定，酶液稀释16倍后备用.

1.5.2提取物的生物活性测定采用酶标法测定抑制单胺氧化酶的活性[8].在96孔酶标板中,分别设3个空白组，3个空白本底组，3个阳性药样品组，1个阳性药本底组，3个样品组，1个样品本底组.空白组及本底组依次加入40 μL酶，40 μL PBS缓冲溶液(pH=7.6)，阳性药组及本底组依次加入40 μL酶，40 μL 阳性药(磷酸异丙烟肼)，样品组及本底组加入40 μL酶，40 μL样品(1 mg·mL-1)，37 ℃孵育20 min，再向各组加120 μL底物(10 mL pH=7.6的PBS 加7.2 μL 4-(三氟甲基)苄胺)，各本底组加120 μL PBS，所有待测样品中加40 μL显色液(3.36 mg香草酸，2.03 mg 4-氨基安替吡啉溶于19.6 mL PBS，加入400 μL辣根过氧化物酶).37 ℃孵育90 min后，在490 nm下用酶标仪测定其吸光度值.根据下式计算抑制率：抑制率(%)=[(空白组-空白本底组)-(样品组-样品本底组)]/(空白组-空白本底组)×100%.

所有样品重复3次，结果计算取平均值.

1.6乙酰胆碱酯酶活性测定

采用改进的Ellman方法[9,10]测定样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性.在96孔酶标板中，与单胺氧化酶相同设定组别.空白组依次加入160 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE(0.28 U·mL-1，pH=7.0 PBS溶解稀释)，本底组加140 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE和20 μL石杉碱甲(1 mg·mL-1)；阳性药组依次加入140 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE和20 μL石杉碱甲(6种不同梯度)，本底组加入155 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)和20 μL石杉碱甲；样品组依次加入140 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE和20 μL样品(1 mg·mL-1)，本底组加入155 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)和20 μL样品.4 ℃孵育20 min，然后在各孔中加DTNB及ATCI各10 μL，37 ℃孵育20 min后在405 nm处用酶标仪测定其吸光度值.根据下式计算抑制率：抑制率(%)=[(空白组-完全抑制组)-(样品组-样品本底组)]/(空白组-完全抑制组)×100%.

所有样品重复3次，结果计算取平均值.

2　结果

2.1分离得到的内生真菌

从露蕊乌头中分离到内生真菌25株，从翠雀中分离到内生真菌8株，从高乌头组织中分离到内生真菌5株，从紫堇中分离到内生真菌3株，从甘青乌头中分离到内生真菌4株(表1).表明药用植物中存在大量的内生真菌.

表1　从植物中分离到的内生真菌

表2　内生真菌发酵提取物抗单胺氧化酶活性

注：Nd表示未测定，LRWT表示露蕊乌头，GWT表示高乌头，CQ 表示翠雀.试验中阳性药磷酸异丙烟肼的IC50值为1.83 μg·mL-1.

2.2提取物对单胺氧化酶的抑制作用

用酶标法测定所有内生真菌提取物对单胺氧化酶的抑制率，结果显示(表2)，露蕊乌头中的2株(WT-39，WT-26-1)、高乌头中的2株(GWT-7，GWT-8)、雀翠中的1株(CQ-17)内生真菌发酵提取物具有强的单胺氧化酶抑制活性.

2.3提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

内生真菌提取物用Ellman法测定抑制乙酰胆碱酯酶活性，得出提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率不高,其中抑制率最高的只有25%(表3).

表3　内生真菌发酵提取物抗乙酰胆碱酯酶活性

3　讨论

老年痴呆症亦称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，简称AD),即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、辨认等方面出现障碍.随着人口的老龄化，其发病率呈逐年上升趋势，因此对老年痴呆症的认识和治疗有重要的医学和社会意义[11].目前科学家提出的主要治疗方法是抑制乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的活性[12].但临床上所用的从天然药物中分离的几种乙酰胆碱酯酶抑制剂，如石杉碱甲、毒扁豆碱等毒性大、选择性低；单胺氧化酶抑制剂苯乙肼长期服用可使肾上腺素α2受体和β受体与递质的亲和力下降[13]；药用植物中的有效成分含量少，生长周期慢，资源匮乏.自1993年Stierle等[14]从短叶红豆杉(Taxussp andreanae)中分离到 1 株产抗癌药物紫杉醇内生真菌以来，从传统药用植物的内生真菌代谢产物中寻找新型活性物质成为内生真菌研究的主流[15].

内生真菌与植物是互利共生的关系，这种共生的关系使双方在生理代谢和遗传基因表达方面都相互影响[16].一些内生真菌与植物共同生长，使这些内生真菌能够代谢产生与宿主植物相同或相近的生理活性成分[17].研究发现几乎所有的植物组织中都有内生真菌的存在[18]，平均每种宿主植物有 4～5 种专性内生真菌，按地球目前已知的30万种植物计算，内生真菌的总数可以超过100万种[19]，郭波等[20]就从抗癌药用植物长春花中筛选到4株能产抗癌药长春新碱的内生真菌.20世纪90年代，人们从微生物中获得乙酰胆碱酯酶抑制剂Cyclophostin，Arisugacin A,B 和 Territrem B,C[21]，周兰兰等[22]发现从白僵菌中提取的BCEF0083具有一定的抗单胺氧化酶的作用，丁海娥等[23]从药用植物的内生真菌中筛选出了16株对单胺氧化酶有不同抑制活性的内生真菌，2株对乙酰胆碱酯酶有活性的内生真菌.这些研究表明从药用植物中筛选对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶有抑制作用的内生真菌的方法可行.

本研究利用已经成熟的菌种分离技术，对5种植物体的内生真菌进行分离，共得到45株菌，制备90种浸膏，通过生物活性测定，结果显示LRWT-L-39的粗浸膏对单胺氧化酶的抑制率最高，它的半抑制浓度达6.47 μg·mL-1，GWT-L-8的粗浸膏对单胺氧化酶的半抑制浓度达9.54 μg·mL-1, LRWT-L-26-1,GWT-L-7,CQ-L-17三株菌对单胺氧化酶的半抑制浓度也在30 μg·mL-1以下，说明这5株菌的次级代谢产物都可能有单胺氧化酶抑制剂的存在，通过跟踪分离有望得到新型的单胺氧化酶抑制剂.另外，发现植物内生真菌中抗乙酰胆碱酯酶活性成分较少，这与文献报道的结果一致.

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(责任编辑俞诗源)

Isolation and bioactivity of endophytic Fungi from medicinal plants

YANG Zhong-duo，DONG Jian-li,ZHAO Wei-hua

(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,Gansu,China)

Endophytic fungi is isolated from medicinal plants and higher inhibition rate of inhibition of monoamine oxidase(MAO) and acetylcholinesterase(AChE) are found from their secondary metabolites.Endophytic fungi is isolated by issue-culture method and purified by potato dextrose agar medium.The fermentation of endophytic fungi are extracted by ethyl acetate,and the mycelium of endophytes are extracted by methanol to obtain methanol fractions．All fungi are tested for AChE and MAO inhibiting activity by colorimetric method in 96-well microplates.Results show that 45 strains of endophytic fungi are isolated and extracted to obtain 90 extracts.Among them,5 strains of Fungi exhibite significant anti-monoamine oxidase activity.The ethyl acetate extract of LRWT-39 are demonstrated to have most high activity against MAO.The active constituents in the endophytic Fungi of medicinal plants are worthy to be further studied.

endophytic Fungi;monoamine oxidase;acetylcholinesterase;secondary metabolites

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.02.016

2015-10-14;修改稿收到日期:2015-12-17

国家自然科学基金资助项目(21262022)

杨中铎(1976—)，男，甘肃临洮人，教授，博士.主要研究方向为天然药物化学.

E-mail:1158989939@qq.com

R 285.5

A

1001-988Ⅹ(2016)02-0079-05