祁　俊　韩晓珂　梁朝锋安徽省芜湖市中医医院制剂室，安徽芜湖　241000

UV-分光光度计法和HPLC-ELSD法同时测定健脾止泻胶囊中多糖含量

祁俊韩晓珂梁朝锋
安徽省芜湖市中医医院制剂室，安徽芜湖241000

目的 建立健脾止泻胶囊多糖的含量测定方法。方法 以无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量；采用1.5mol/L硫酸溶液水解多糖，通过碱中和、乙醇沉淀的方法得到单糖，用HPLC-ELSD方法测定其含量；色谱条件：色谱柱为Xbridge Amide column（4.6 mm×150mm，3.5μm）；流动相为乙腈∶0.1%三乙胺（75∶25）；柱温：30℃；流速为1.0mL/min；ELSD漂移管温度为95℃；气体流速为3.0 L/min。结果 苯酚-硫酸法中，葡萄糖在6.8～68.0μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系（r2=0.9995），平均回收率为96.1%。HPLC-ELSD法中，无水葡萄糖在0.0507～0.8110mg/mL范围内呈现良好的线性关系（r2=0.9998），平均回收率为97.1%，RSD为1.4%。两种测定方法测定多糖的平均含量分别为22.3%、15.2%。结论 该方法稳定可行，重复性好，可以作为健脾止泻胶囊多糖的含量测定方法。

健脾止泻胶囊；无水葡萄糖；苯酚-硫酸法；HPLC-ELSD法

健脾止泻胶囊为芜湖市中医医院即将申报的院内制剂品种，为名老中医临床经验方，本方由茯苓、薏苡仁、白芍、山药、党参、白术等药味组成，具有补益脾胃，兼以渗湿止泻。茯苓既能健脾，又能渗湿，与党参、白术、山药等配伍，对于脾虚运化失常所致泄泻、带下，有标本兼顾之效。茯苓的主要化学成分为茯苓糖，含量约为84.2%，其中β-茯苓聚糖为主要成分，即茯苓多糖［2］。在多糖测定时，一般常用硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法作为多糖的含量测定方法［3］。另外多糖的定性和定量组成可通过酸催化水解多糖成单糖或寡糖后再进行分析［4］。甲醇分解、乙酰分解作用、甲醛分解作用、酶水解等方法也可用于多糖降解。本研究运用了苯酚-硫酸法测定了多糖的含量，由于文献报道苯酚-硫酸法稳定性均较差，重现性也不理想，故本研究同时采用硫酸水解，通过中和、沉淀等处理后，利用HPLC-ELSD色谱技术对其成分含量进行了检测。

1　仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪；Alltech 2000ES蒸发光散射检测器；TU-1901双光束紫外可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限责任公司）；D-无水葡萄糖（中国药品生物制品检定研究院，批号：110833-200904）；XP205电子天平（瑞士梅特勒公司）；优普医疗纯水制造系统；GZX-9140MBE数显鼓风干燥器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；HHW-4数显恒温水浴锅（金坛市双捷实验仪器厂）；高纯氮（安徽金鼎锅炉股份有限公司，纯度≥99.999%）；乙腈（HPLC/ Spectro，美国TEDIA公司）；硫酸、正丁醇、无水乙醇、甲醇、乙醚均为分析纯。

2　UV-分光光度计法测定总糖含量

2.1对照品溶液的制备

取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每毫升含40μg的溶液，即得［5-12］。

2.25%苯酚溶液的制备

取苯酚100 g，加铝粉0.1 g，碳酸氢钠0.05 g，蒸馏收集182℃馏分，称取此馏分5 g，置100 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，备用。

2.3最大吸收波长的测定

精密量取葡萄糖对照品溶液2mL，精密加入5%苯酚水溶液1mL、浓硫酸7mL，混匀，于水浴中20min，取出，于冰浴中5 min。另以未加葡萄糖的溶液参比，分别于200～800 nm范围内扫描，最大吸收波长为490 nm。见图1。

图1　葡萄糖-苯酚硫酸法紫外扫描图

2.4供试品溶液的制备

取样品（批号140301）约0.4 g，精密称定，加入50mL无水乙醇加热回流2 h，滤过，残渣挥至无醇味，将残渣和滤纸置烧瓶中，加入50 mL水回流提取2次，每次2 h，趁热过滤，残渣及烧瓶用热水洗涤，洗液与滤液合并，浓缩转移至100mL量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL至25 mL量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5标准曲线的配制

分别精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，置于10mL的量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，配成系列标准品溶液。精密量取2mL，精密加入5%苯酚水溶液1mL、浓硫酸7mL，混匀，水浴加热20min，取出，冰浴5min。以蒸馏水为空白，在490 nm波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图，得标准曲线方程A=0.0136X-0.0069（r2=0.9995）。

2.6精密度试验

取样品（批号140301）约0.4 g，精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.5”项下自“精密量取2mL”起依法操作，测定吸光度，连续测定6次，计算吸光度RSD为0.78%。表明精密度良好。

2.7稳定性试验

取样品（批号140301）约0.4 g，精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.5”项下自“精密量取2 mL”起依法操作，测定吸光度，分别于0、1、2、4、6、8、10、24 h测定，计算吸光度RSD为1.27%，说明在样品显色之后24 h内稳定性良好。

2.8重复性试验

取样品（批号140301）约0.4 g，6份，精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.5”项下自“精密量取2mL”起依法操作，测定吸光度，计算其平均含量为22.3%，RSD为1.16%。表明该方法重复性良好。

2.9加样回收率试验

取已知含量的样品（批号140301）约0.2 g，6份，精密称定，加入50mL无水乙醇加热回流2 h，滤过，残渣挥至无醇味，将残渣和滤纸置烧瓶中，精密加入葡萄糖对照品适量，加50 mL水回流提取2次，按“2.4”项下方法制备供试品，按照“2.5”项下自“精密量取2 mL”起依法操作，测定吸光度，结果表明加样回收率符合要求。见表1。

表1　加样回收率试验

2.10样品含量测定

取3批样品各约0.4 g，精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.5”项下自“精密量2 mL”起依法操作，测定吸光度，结果见表2。

表2　样品含量测定

3　HPLC-ELSD法测定总糖含量

3.1色谱条件

色谱柱：Xbridge Amide column（4.6mm×150mm，3.5μm）；流动相：乙腈∶0.1%三乙胺=75∶25；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；蒸发光散射检测器，漂移管温度：95℃；气体流速：3.0 L/min；理论塔板数按D-葡萄糖峰计算应不低于3000［13-18］。

3.2对照品溶液的制备

精密称取D-无水葡萄糖2份，分别加水制成每毫升含0.30mg和0.80mg的溶液，即得。

3.3供试品溶液的制备

取样品约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水饱和正丁醇25mL，超声处理30min，放冷，4000 r/min离心10min，倾出上清液，沉淀加入配制好的1.5mol/L硫酸溶液25mL，沸水浴3 h，取出，冷却至室温，滴加30%KOH溶液中和至pH值6～7，加入无水乙醇使含醇量达到70%，静置片刻，4000 r/min离心10 min，取上清液，减压回收乙醇至适量，转移至100mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取对照品液与供试品液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。HPLC-ELSD色谱图见图2～3。

图2　D-无水葡萄糖HP LC-EL SD色谱图

图3　样品HPLC-ELSD色谱图

3.4线性试验

取D-无水葡萄糖适量，精密称定25.35 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，即得。从上述对照品溶液中分别精密移取适量，配成0.0507、0.1014、0.2028、0.4055、0.6083、0.8110 mg/mL的系列浓度对照品溶液，摇匀，进样量为10μL。以峰面积的对数值为横坐标（X），进样浓度的对数值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到回归方程为Y=0.5252X-3.9398 （r2=0.9998），结果表明D-无水葡萄糖在0.0507～0.8110mg/mL范围内呈现良好的线性关系。

3.5精密度试验

取D-无水葡萄糖对照品（0.4055 mg/mL）溶液，精密吸取10μL，重复进样6次，测得峰面积积分值，计算RSD为0.65%。结果表明仪器的精密度良好。

3.6稳定性试验

取样品约0.3 g，精密称定，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μL，分别在第0、2、4、6、8、10小时进样一次，共进样6次，测得峰面积积分值，计算RSD为1.33%，说明该方法稳定性良好。

3.7重复性试验

取样品约0.3 g，精密称定，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，6份，测定，结果D-无水葡萄糖的平均含量为15.2%。表明该方法重复性良好。

3.8加样回收试验

取样品约0.15 g，精密称定，分别精密加入D-无水葡萄糖对照品适量，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，测定，结果表明加样回收率试验结果符合要求。见表3。

表3　加样回收率试验

3.9样品含量测定

取3批样品各约0.3 g，精密称定，按“3.3”项下方法进行制备，进样，测定，结果见表4。

表4　3批样品含量测定结果

4　讨论

苯酚-硫酸法测定原理是根据多糖在硫酸的作用下先分解成单糖分子，并迅速脱水生成糠醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物测定［19-21］，此方法专属性较差，但稳定性较好，弥补了HPLC-ELSD法测定中由于对照品单一而使结果偏小的缺点；HPLC-ELSD法是通过将多糖完全水解，通过测定葡萄糖来反映多糖的含量，克服了多糖含量测定中专属性不强的缺点，在以后的研究过程中，可以选用不同的单糖对照品来进行测定，使实验结果更加真实、可信，能更好地反映多糖的含量及各个单糖的比例。

在色谱条件的选择上，考察了样品在乙腈和水、乙腈和0.1%三乙胺、乙腈和0.2%三乙胺系统中的分离情况。结果乙腈和水比例在（81∶19）、（85∶15）、（89∶11）3个系统中，对照品葡萄糖均为两个峰，而在乙腈和0.1%三乙胺系统中，对照品葡萄糖为单峰，说明三乙胺能加速葡萄糖两个构型之间的转化。乙腈和0.2%三乙胺系统与乙腈和0.1%三乙胺系统没有明显差异，故选择乙腈和0.1%三乙胺系统。

在前处理的过程中，考察了甲醇、无水乙醇、正丁醇、水饱和正丁醇、乙醚处理后样品中葡萄糖的含量，结果乙醚前处理后得到的葡萄糖含量最高，但考虑到样品中含有苷类成分，乙醚前处理不能有效地将其去除；甲醇、无水乙醇能有效地去除大量的苷类成分，但小分子的葡萄糖也有可能被除去。综合考虑之下，又对正丁醇和水饱和正丁醇去除苷类能力进行了进一步的考察，结果水饱和正丁醇处理后样品中芍药苷的含量为0.05%（原2.8%），故选择水饱和正丁醇作为前处理的试剂。

在样品的处理过程中，对水解时间进行了考察，选择了1、2、3、4 h作为考察对象，结果在3 h时水解比较完全，所以选择水解时间为3 h；对醇沉浓度进行了考察，选择了50%、60%、70%、80%作为考察对象，结果4个不同的醇沉浓度对结果影响不大，考虑到醇沉效果及尽量避免葡萄糖的损失，确定最终的醇沉浓度为70%。

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Determination of polysaccharide content in Jianpizhixie Capsules by UV-spectrophotometry and HPLC-ELSD method

QI JunHAN XiaokeLIANG Chaofeng
Preparation Room，Wuhu Hospital of TCM，Anhui Province，Wuhu241000，China

Objective To establish a determination method for polysaccharide in Jianpizhixie Capsules Methods Anhydrous glucose was used as

ubstance.Total sugar content was determined by phenol-sulfate acid method；1.5mol/L hydrolyzed polysaccharide sulfate solution was used，the method of alkali neutralization and ethanol precipitation was used to get simple sugars.The HPLC-ELSD method was used to determine its content.Chromatographic condition:chromatographic column was Xbridge Amide column（4.6mm×150mm，3.5μm）；Mobile phase was acetonitrile-0.1%triethylamine（75∶25），column temperature was 30℃，flow rate was 1.0 mL/min，temperature of ELSD was 95℃，gas flow rate was 3.0 L/min.Results Phenol-sulfate acid method of anhydrous glucose was linear in the ranges of 6.8-68.0μg/mL（r2=0.9995），the average recovery rate was 96.1%.HPLC-ELSD of anhydrous glucose was linear in the ranges of 0.0507-0.8110mg/mL（r2=0.9998），the average recovery was 97.1%，RSD=1.4%.The average contents of two kinds methods for determination of polysaccharide were 22.3%，15.2%.Conclusion The method is stable and feasible，has good repeatability and can be used as the polysaccharide content determination of Jianpizhixie Capsules.

Jianpizhixie Capsules；Anhydrous glucose；Phenol-sulfate acid method；HPLC-ELSD method

R927.2

A

1673-7210（2016）01（c）-0039-05

2015-09-30本文编辑：赵鲁枫）

祁俊（1966-），男，副主任中药师，主要从事中药制剂配制、质量标准研究和制剂管理工作。

韩晓珂（1981-），女，硕士，主要从事中药制剂配制、质量标准研究工作。