李　静　陈　军　李秀玉　牛潞芳.海军总医院中医科，北京　00048；.陕西中医学院针灸推拿系，陕西咸阳　7046

模拟微重力对骨髓间充质干细胞全细胞瘤苗干预A549移植瘤增殖的研究

李静1陈军2李秀玉1牛潞芳1
1.海军总医院中医科，北京100048；2.陕西中医学院针灸推拿系，陕西咸阳712046

目的 比较骨髓间充质干细胞（MSCs）于不同重力环境下获得全细胞抗原（WCAs）对于人肺腺癌细胞株A549荷瘤的影响。方法 全骨髓贴壁法原代培养小鼠MSCs，采用2D回转模式，以30 r/min水平回转模拟微重力（MMG）培养条件，并以正常重力（NG）为对照培养MSCs；随后以15 Gy的X线灭活MSCs获取WCAs，将BALB/c小鼠随机分成4组，实验组（MMG组）皮下接种WCAs为（1次/3 d，共2周）；对照组分别为PBS组，NG组，A549组；各组均采用A549细胞系皮下移植荷瘤，观察4组小鼠肿瘤生长情况；测量肿瘤直径、计算肿瘤体积，并采用免疫组化法检测增殖细胞核抗原（PCNA）表达。结果 肺腺癌A549细胞皮下移植使小鼠成功荷瘤，MMG可促进WCAs抑制移植瘤的生长。MMG组肿瘤体积显著小于PBS组与NG组（P＜0.05）；NG组及MMG组的肿瘤至第6天方见生长，MMG组移植瘤体积显著小于NG组（P＜0.05）。同时，A459组的抑制作用最强；PBS组肿瘤最大；12 d对各组移植瘤称重，其中NG组为（458.7±21.6）g，MMG组为（315.6±18.5）g，MMG组的抑制作用显著高于NG组（P＜0.05）。HRP标记染色提示MMG可增强WCAs的免疫刺激，使得PCNA表达下调（P＜0.05）。结论采用MSCs获得WCAs进行免疫应激可产生抑制肿瘤生长作用，MMG可加强其抑瘤作用，能显著观察到PCNA表达下调，其内在的免疫分子机制有待深层次的探索。

骨髓间充质干细胞；肿瘤；模拟微重力

有关肿瘤发生“胚胎”属性的认识由来已久，“cancer”源于古希腊语，意味着“anaplasia（返祖）”，其内涵就是“to from backwards（回到起点）”。去分化（dedifferentiation）属性，指某种情况下，一些细胞失去它原本所在组织的结构和功能，成为一个具有未分化细胞特征的细胞，而具备这种特性的细胞往往都是肿瘤细胞［1］。正是基于此设想，一百多年来，研究人员尝试采用胚胎组织进行裂解获得瘤苗抗原，评估其对移植瘤抑瘤效果并取得初步结论［2］，即干细胞或胚胎组织的粗抗原可产生类似肿瘤疫苗的作用。本研究组早前也初步摸索，发现骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）获得全细胞抗原 （whole cell antigens，WCAs）可以产生抑瘤作用［3-4］。进一步评估发现，通常条件下MSCs瘤苗的抑瘤效率低，这可能将成为制约瓶颈有待突破。因此，探索可以提高全细胞瘤苗免疫原性的方法或策略显得尤为迫切。本研究采用模拟微重力（MMG）干预MSCs全细胞抗原后进行免疫接种，评估比较不同重力模式下MSCs的WCAs的抑瘤作用。

1　材料与方法

1.1实验材料

BALB/c系小鼠（合格证号：军KS-2012-0004，军事医学科院动物中心）；CO2恒温培养箱 （Thermo 140型，美国HERA cell），普通离心机（HDL-40B型，成都科学仪器厂），2D回转仪（中国科学院），台式低温高速离心机（Labofuge 400R型号，德国Heraeus），倒置显微镜（CKX31型，日本Olympus）；低糖DMEM（美国Hyclone），胎牛血清 （美国Hyclone），PCNA-鼠单抗（美国Abcom），辣根过氧化物酶（HRP）-二抗（北京中杉公司）。

1.2方法

1.2.1MSCs、A549培养与全细胞抗原的制备

1.2.1.1MSCs全骨髓贴壁法培养MSCs，6周龄小鼠的股骨和胫骨，10%FBS-低糖DMEM冲出骨髓，接种于培养瓶里，24～48 h后去悬浮，每3～4天换液，直至需要传代。

1.2.1.2人肺腺癌A549细胞从液氮罐中取出A549细胞冻存管，放入37℃水浴锅中解冻，1000 r/min离心5 min，PBS吹打、离心后，以10%FBS+5%RPMI-1640培养，2～3 d换液，直到需要传代。

1.2.1.3MSCs全细胞抗原制备X线照射裂解法获得抗原，调整3～5代A549细胞密度为1×106，于培养皿中行X线照射，强度为15 Gy，时间30 s；照射后的抗原4℃保存不超过6 h。

1.2.2CCK8细胞活力检测

在96孔板中接种浓度为2×104个/孔的2种细胞（MMG与NG分别培养的MSCs）悬液，置于培养箱中预培养（37℃，5%CO2）；接种细胞后分别于第3、6、9、12天加入10μLCCK8溶液；培养箱内孵育2 h；酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.3MMG干预

采用2D回转模拟微重力培养条件［5-6］，MSCs细胞分为MMG组与正常重力（NG）对照组，MMG组细胞上回转仪上模拟失重（经计算以30 r/min为最佳效果），在此回转条件下重力及切应力对细胞产生的影响会降至最低［7］。MSCs长至融合后，消化细胞接种于盖玻片上，随后置于6孔培养板中，调整细胞密度为2×105个/孔；贴壁后上回转仓，将爬片插入到特制的Fixing铁架上，每个铁架相应放入4个玻片，置于小室，加入培养基（37℃，10%低糖DMEM）；拧紧盖子安装至回转器上，整个回转系统放置在 37℃恒温培养箱，以30 r/min旋转回转48 h。NG对照组所有操作相同，即爬片后入小室，但小室不上回转器。

1.2.4移植瘤荷瘤造模及实验分组

选择3～4周龄雄性小鼠，每组6只。依据免疫应激抗原的不同分为4组：PBS组、A549组（A549裂解获得WACs）、MMG组（MMG干预后MSCs裂解获得WACs）、NG组（NG干预后MSCs裂解获得WACs），实验组为MMG组，余3组为对照。NG组与A549组小鼠每3天接受1次皮下注射瘤苗刺激（抗原液加PBS 共2mL），2周后（共5次）进行肿瘤荷瘤造模。PBS组每3天接受1次皮下注射2 mL的PBS，2周后荷瘤造模。整体实验流程详见图1。

图1　实验流程图

1.2.5A549皮下移植造模及肿瘤测量

1.2.5.1造模获得复苏后3～4代A549细胞，调整细胞密度为1×106接种小鼠上肢下方（腋窝下）皮肤。

1.2.5.2测量按皮下肿瘤体积及形状进行动态观察，接种后分别于3、6、9、12 d观察肿瘤增长，测量最长径与最短径，计算肿瘤体积，公式为V=1/6πab2（a为长径，b为短径），单位为毫米（mm）。并在12 d处死小鼠，切下肿瘤，电子秤称量肿瘤的重量，单位为克（g）。

1.2.6HE染色及PCNA的表达

12 d获取肿瘤组织，固定、脱水、包埋、切片。

1.2.6.1HE染色切片蒸馏水漂洗入苏木精染色，酸水及氨水中分色；自来水冲洗过蒸馏水；分别入酒精中脱水，伊红染色液染色；脱水、透明、封固。

1.2.6.2免疫组化 二甲苯脱蜡，入3%H2O2浸泡10min抗原修复，5%BSA封闭，加一抗，4°C过夜；PBS冲洗，加上HRP标记二抗，然后37°C孵育半小时；显色、苏木精复染、脱水、封片。

1.2.6.3结果观察倒置显微镜下，伊红淡染示细胞浆，胞核被蓝色复染记一个完整细胞，在此基础上记录HRP标记（褐色沉淀）记录阳性细胞数，于10倍下观察，分别取3个视野后计数平均数。

1.3统计学方法

采用统计软件SPSS 14.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MMG干预MSCs的细胞形态和增殖情况

在NG组（正常对照），爬片1d即可见较多细胞贴壁，呈纺锤形和多角形，可见细胞核；而MMG组采用MMG干预后细胞出现“圆形”改变，细胞间距增大，排列稀疏。见图2。本研究采用CCK8检测细胞活力，于第3、6、9、12天分析OD值，具体见图2；提示MMG可影响细胞增殖。

2.2MMG上调MSCs的WCAs抑瘤作用

本研究分别获得NG及MMG条件下MSCs的WCAs，以WCAs刺激小鼠获得免疫应激模型，同时以A549细胞及PBS行实验对照；其中阳性对照组的WCAs抑制最强。3 d时，4组均未观察到明显的肿瘤产生。6 d时，A549组未观察到明显的肿瘤产生，PBS组体积［（45.5±16.4）mm3］，MMG组［（19.03±6.5）mm3］，NG组［（26.4±9.2）mm3］，与NG组比较，PBS组增大（P＜0.05），MMG组减小（P＜0.05）；与MMG组比较，PBS组与NG组均增大（P＜0.05）。9 d时，A549组未有肿瘤产生，PBS组体积［（83.5±12.6）mm3］，MMG组［（26.7±5.9）mm3］，NG组［（57.7±10.2）mm3］，与NG组比较，PBS组明显增大 （P＜0.05），MMG组明显减小（P ＜0.05）；与MMG组比较，PBS与NG组均增大 （P＜0.05）。12 d时，A549组肿瘤体积［（6.03±1.21）mm3］，PBS组体积［（138.7±9.4）mm3］，MMG组［（41.9±8.1）mm3］，NG组［（79.7±12.4）mm3］；与A549组比较，其余组别移植瘤均增大（P＜0.05）；与PBS组比较，各组体积均减小（P＜0.05）；与 NG组比较，PBS组明显增大（P＜0.05），MMG组与A549组明显减小 （P＜0.05）；与MMG组比较，A549组较小 （P＜0.05），PBS组与NG组均增大（P＜0.05）。见表1。

图2　MMG对细胞增殖的影响

12 d处死小鼠切下移植瘤进行称重，PBS组［（892.3±10.6）g］，NG组［（458.7±21.6）g］，MMG组［（315.6± 18.5）g］，A549组［（114.2±16.7）g］，与A549组比较，其余组别移植瘤均增大（P＜0.05）；与PBS组比较，各组体积均减小（P＜0.05）；与NG组比较，PBS组明显增大（P＜0.05），MMG组与A549组明显减小（P＜0.05）；与MMG组比较，A549组较小 （P＜0.05），PBS组与NG组均增大（P＜0.05）。见图3。

表1　MMG对MSCs瘤苗抑瘤体积的影响（mm3，±s）

表1　MMG对MSCs瘤苗抑瘤体积的影响（mm3，±s）

注：与PBS组比较，#P＜0.05；与NG组比较，△P＜0.05；与MMG组比较，▲P＜0.05；与A549组比较，*P＜0.05

组别　3 d　6 d　9 d　12 d PBS组NG组MMG组A549组0000 45.5±16.4#26.4±9.2△19.0±6.5▲0 83.5±12.6#57.7±10.2△26.7±5.9▲0 138.7±9.4#79.7±12.4△41.9±8.1▲6.0±1.2*

图3　MMG对MSC s瘤苗抑瘤1 2 d质量的影响

2.3MMG抑制移植瘤区PCNA的表达

获取12 d的肿瘤组织，石蜡包埋切片后行PCNA组化染色（图4a），并HE染色，可以看到均匀分布的腺癌细胞，胞浆红染（图4c）；其表达均数为：PBS组为（122.3±0.1）个，A549组为（31.6±0.1）个，NG组为（77.5± 0.1）个，MMG组为（60.2±0.1）个。与PBS组比较，其他组PCNA细胞均降低（P＜0.05；与NG组比较，MMG组、A549组PCNA细胞降低（P＜0.05），PBS组升高（P ＜0.05）；与MMG比较，A549组PCNA表达稍低（P＜0.05），NG组与PBS组均升高（P＜0.05）；与A549组比较，其他组表达均升高（P＜0.05）。见图4。

图4　瘤体PCNA表达情况

3　讨论

肿瘤组织的异质性与其去分化属性高度相关，系指在某种情况下，一些细胞失去它所在组织的结构和功能，呈现未分化特征，这些属性其实就是胚胎属性［9］。病理学家经常通过评估比较靶细胞与本体组织的胚胎属性标识该肿瘤的分化程度，肿瘤细胞越接近于胚胎属性其恶性程度往往越高［10］。正是这种肿瘤起源的探索［12］，人们猜想采用胚胎组织或可实现肿瘤的预防接种，然而此类探索一直未得到有效突破，直到近年来干细胞理念和技术的进步，使得人们真正地论证了干细胞瘤苗的肿瘤预防接种作用。

2009年Li等［2］首次采用胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESs）作为免疫种子，发现其对结肠癌株CT26的移植瘤有明显的抑制作用；随后又有学者发现ESs对肺腺癌细胞的移植瘤也有明显的抑制作用。进一步的研究表明，该抑制机制可能与T细胞介导的细胞毒作用（cytotoxic T lymphocyte response，CTLs）上调高度相关［11］。由于伦理及培养条件的显著ES地肿瘤全细胞疫苗的研究面临许多挑战。

近两年，本项目组对成体干细胞——MSCs的免疫抑瘤作用进行了探索，发现其同样具有抑瘤接种作用［3］。研究证实，MMG可使得细胞呈现巨大改变，那么是否可以改变其WACs特性呢？本文旨在分析MMG作用下，MSCs的WACs作用改变的情况。本项目之所以构建A549组源瘤模型，是源于20世纪肿瘤WCAs“专职”免疫抑制的假说［10］，采用干细胞对其进行比较一方面可以间接比较MSCs的抑瘤作用；另对于肿瘤的预防可能更具有潜在的临床意义。

在重力消失的情况下，组织、细胞会产生与正常地球重力作用下迥异的结构与功能，并且研究人员已经利用这种差异推行在组织工程学中［16］，而其模拟方式，无论是一维、二维或三维，都是选择合适的速度进行回转来最大程度地减轻重力的影响［17-18］；本研究团队长期进行细胞空间动力的研究，以二维回转培养为主，反复验证其结果可靠［6，8］。本次研究中，将MSCs采用MMG干预48 h后通过X线裂解获得WCAs；较之正常对照组，MMG组的抑瘤作用提高。本研究显示早期接种3 d的肿瘤增殖无明显改变，但是随着时间的延长至第6天时其差异有统计学意义（P＜0.05）。有学者曾分析了ESs肿瘤增殖改变情况，发现疫苗接种后随着时间延长，肿瘤抑制愈明显；并深入分析不同肿瘤负荷程度下干细胞瘤苗抑瘤的差异，认为低负荷组肿瘤抑制效果更为显著［15］。本研究切下移植瘤分析其重量和形态学变化，发现质量的改变与体积的改变同步，提示肿瘤内部尚未存在空洞或液化等干扰因素，但是需要进一步采用小动物影像摄像进一步证实［16］。PCNA在细胞增殖的启动上起重要作用［17］，是反映细胞增殖状态的敏感指标［18-20］，本研究发现，MMG 组PCNA的表达较NG对照组更低，提示肿瘤抑制率提高。本研究初步分析MMG可提高MSCs全细胞抗原的抑瘤能力并可直接抑制细胞增殖。

在获得这些初步数据后，更多的疑问摆在面前，MSCs抑瘤的作用是否也与CTL作用有关？MMG是否也是通过该途径的变化发挥其作用的？MMG是否有长效抑瘤的作用，是否能触发机体长效的免疫“记忆”。因此，此后本项目组将针对这些突出问题开展进一步研究。

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Study of simulated microgravity affecting antitumor response of mesenchymal stem cells against A549 transplantation tumor

LI Jing1CHEN Jun2LI Xiuyu1NIU Lufang1
1.Department of Traditional Chinese Medicine，PLA Navy General Hospital，Beijing100048，China；2.Department of Acupuncture and Massage，Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi Province，Xianyang712046，China

Objective To estimate the whole cell antigens（WCAs）of mesenchymal stem cells（MSCs）cultured in different gravity can generate different immune response against cancer in mice which induced by lung cancer cell line A549.Methods The MSCs was isolated and cultured adherent cells from marrow and a 2-dimensional clinostat（2D clinostat）was used to keep cells in continuous 2D rotation at a speed of 30 r/min around the horizontal axis，to mimc the microgravity（MMG），and the normal gravity（NG）was used as control.And then MSCs was to irradiate to X-ray（15Gy）to get the WCAs.The experiment group （MMG group）was immunized with WACs（once/3 d，2 weeks）and then the mice were challenged with A549 cells；the control mice immunized subcutaneously with PBS control（PBS group），MSCs-NG control（NG group）and A549 control（A549 group），mice were monitored for their tumor growth by measure the diameter；then the weight and volume was plotted；the expression of PCNA was monitored by immunohistochemisty. Results A well-established lung cancer（A549）model was established，MMG could improve the immune responses against A549 lung carcinoma（P＜0.05）.The A549 group had strongest inhibit effect，while the PBS group had the biggst tumor，the tumor of MMG group and NG group were found beginning to grow until 6 d；and the size in MMG group was smaller than NG group（P＜0.05）；the weight of tumor were measured on 12 d，it showed that the weight of NG group was（458.7±21.6）g，while in MMG was（315.6±18.5）g；the resist effet in MMG group was bigger than NG group （P＜0.05）.HRP stain showed MMG could down-regulated the PCNA expression（P＜0.05）.Conclusion Immunization of with MSCs getting WCAs can suppress tumor growth，MMG can enhance this suppressing effect，it can be observed PCNA expression down，the further immune mechanism need more exploring.

Mesenchymal stem cells；Cancer；Modeled microgravity

R734.2

A

1673-7210（2016）01（c）-0008-05

2015-10-25本文编辑：苏畅）

国家自然科学基金青年科学基金项目（8110 2678）。

李静（1981-），女，博士；研究方向：恶性肿瘤的中医治疗。