曹志伟,孙忠晟,郭学金,王建琳,尹燕博

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.青岛澳兰百特生物工程有限公司,山东青岛266101)

鸡I型IFN及TLR-3和TLR-7实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

曹志伟1,孙忠晟2,郭学金1,王建琳1,尹燕博1

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.青岛澳兰百特生物工程有限公司,山东青岛266101)

为检测鸡抗病毒相关基因在病毒感染过程中的动态变化规律,研究建立了鸡IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的实时荧光定量RT-PCR的检测方法.根据GenBank提供的鸡IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7参考序列设计了相应的特异引物,用常规RT-PCR方法从鸡脾脏总RNA中扩增得到鸡相应基因.将其cDNA分别克隆到pMD19-T载体中进行测序鉴定,采用SYBR Green I染料法,建立标准曲线并分析其溶解曲线.结果表明,这4种基因的检测灵敏度可高达46 copies/μL,且具有良好的特异性和重复性.此检测方法的建立为动态定量检测及研究鸡IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因的表达变化提供了有效的手段.

IFN-α;IFN-β;TLR-3;TLR-7;实时荧光定量PCR

Corresponding authors:WANG Jian-lin;YIN Yan-bo

I型干扰素(Interferon,IFN)包括IFN-α和IFN-β,是机体抗病毒防御的重要组成,不仅可以通过细胞表面受体作用可使细胞产生抗病毒蛋白,同时还可增强NK细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力,被视为机体的免疫指示器[1-2].I型IFN的合成和表达是通过机体的模式识别受体的活化来完成的,其中TLR是关注较多的模式识别受体.鸡的10个TLR中,和天然免疫相关的主要有TLR-3,TLR-7和TLR-15,而研究较多的为TLR-3和TLR-7[3],分别识别双链RNA和单链RNA,二者被活化后可表达一些天然抗病毒因子,如I型IFN和促炎性细胞因子,发挥机体抗病毒天然免疫[4].

TLR-3和TLR-7可活化表……