赵　川，黄光远，张梦思，李和贤，周作勇，黄庆洲

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460）

重庆某鳄鱼馆病死暹罗鳄大肠杆菌分离鉴定及药敏试验

赵川，黄光远，张梦思，李和贤，周作勇，黄庆洲

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460）

2015年4月至5月间，重庆某鳄鱼馆3只9岁龄暹罗鳄发病，4月21日死亡1只。发病情况：3只暹罗鳄从2014年秋季开始发生局部皮肤皲裂，并从裂口处流出黄水，4、5 d后形成淡白色溃疡，发病期间食欲不振，不愿移动，用氨苄西林胶囊、甲硝唑粉皮肤裂口处外用，同时头孢曲松钠肌肉注射，几天后稍有好转，但不能痊愈。2015年开春后，发病更为严重，经常发生皮肤皲裂溃烂，4 月18日1只发病鳄不食，卧地不动，排少量黄色恶臭稀便，4月21日死亡。剖检可见肺高度腐败、恶臭，心表面有大量豆腐渣样沉积物，肠壁充血、水肿，肝肿胀，表面有少量纤维素性透出物。其他两只发病鳄临床症状相似。根据内脏剖检特征，疑似大肠杆菌感染，并从病死鳄肺、肝、心组织中均分离到大肠杆菌，敏感试验表明，分离菌对阿米卡星敏感，建议鳄鱼馆立刻使用该药，用药5 d后，情况开始好转，2周后基本痊愈。现将该鳄鱼馆大肠杆菌的分离鉴定、药敏试验及治疗情况报告如下。

1　材料与方法

1.1材料主要仪器：BA2303光学显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、PCR仪、DYY-8C电泳仪、凝胶成像分析系统。

主要药品：普通琼脂培养基、S.S.培养基、麦康凯培养基、LB营养肉汤；细菌基因组DNA提取试验盒（广州飞扬生物工程有限公司，批号：2661445）；PCR试剂盒（TaKaRa公司）；药敏纸片（批号：121012，杭州天和微生物试剂有限公司）。

试验动物：昆明种普通级小鼠20只（由西南大学荣昌校区实验动物科提供）。

1.2方法

1.2.1目标菌分离取病死鳄鱼肝、肺组织及心血分别接种于LB营养肉汤，置37℃、增菌培养24 h，将培养物划线接种于普通营养琼脂平板，获得单个菌落后进行鉴定。

1.2.2分离菌鉴定将目标菌划线接种于麦康凯培养基、S.S.营养琼脂培养基上，37℃，恒温培养24 h，观察菌落特征，同时将纯培养疑似菌革兰染色镜检。

将分离菌接种到硫化氢、葡萄糖、木胶糖等微量糖发酵管内，同时进行吲哚、M.R.、V-P试验，37℃恒温培养24 h后，观察产酸、产气情况。

1.2.3分离菌16S rRNA基因PCR扩增及序列测定

参照刘洋等[1]方法进行。提取分离菌DNA，以16S rRNA通用引物进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，比较扩增目的基因片段大小，并将PCR产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，登入NCBI将测得的序列在BLAST中检索细菌同源性。

1.2.4小鼠致死性试验将纯培养菌株接种营养肉汤，37℃培养24 h，用灭菌生理盐水稀释成1～2×108个菌悬液备用；每株分离菌腹腔接种5只健康小鼠0.2 mL/只，同时设5只健康小鼠注射等量无菌营养肉汤液作为对照。观察并记录小鼠在接种后72 h内的死亡情况。

1.2.5药敏试验采用纸片扩散法[2]进行。

1.2.6治疗方案根据药敏试验结果，选择敏感抗生素对其他两只发病鳄鱼进行治疗，考虑发病及不食时间较长，建议肌肉注射肌苷、辅酶A、ATP能量合剂适量，每天1次，连用7 d，根据用药后鳄鱼活动、精神、叫声、食欲情况判定治疗效果。

2　结果

2.1分离菌株的培养及形态特征鳄鱼肝、肺及心组织分别接种于LB营养肉汤培养24 h后均浑浊，分别接种在营养琼脂培养基上生长菌落形态相似，直经1～2.5 mm灰色半透明、表面光滑、湿润、边缘整齐的圆形菌落；在S.S.与麦康凯琼脂均长出红色、隆起、光滑、直径1～3 mm的桃红色菌落；革兰染色镜检为红色、两端钝圆的单个或成对排列的革兰阴性短杆菌。

2.2分离菌生化试验从肺、心血、肝组织中分离到的3株菌生化试验结果基本一致，除心血株产酸产气不同外，其他生化项目均相同。结果见表1。

表1　分离菌株的生化试验

2.3分离菌16S rRNA扩增、测序及分析选心血分离到的菌株进行16S rRNA扩增，得到单一、大小在1 500 bp左右、与目标基因片段大小相符的条带，而且无明显非特异性扩增条带，结果见图1。测序结果序列长度为1 500 bp，经Blast在线比对分析，分离菌16S rRNA序列与GenBank已收录的大肠杆菌（ATCC Escherichia coli ACN001，登录号为 gb⁃CP007442.1）相应的基因序列同源性高达99%。

1：DL Marker plus；2～3：分离菌扩增条带

2.4致病性试验从心血、肺、肝组织分离到的3株菌，分别接种小鼠后48 h内均全部死亡，死亡率100%，从死亡小鼠肝脏中分离获得与接种菌一致的短杆菌，而对照组小鼠72 h内全部健康存活。

2.5药敏试验分离菌对阿米卡星、卡那霉素、大观霉素、链霉素、氟苯尼考敏感；而对临床常用的沙星类及头孢类药物耐药。结果见表2。

表2　分离菌药敏试验结果

2.6治疗效果根据药敏试验结果，建议鳄鱼馆兽医将发病鳄鱼隔离饲养，选用阿米卡星，按体重5万单位/kg，肌肉注射，每天1次，给正在发病的其他两只鳄鱼连续用药7 d，同时因发病鳄鱼进食极少，精神不振，使用肌苷200 mg、辅酶A10 mg、三磷酸腺苷（ATP）40 mg能量合剂混合，肌肉注射，每天1次，连续用药7 d；结果用药5 d后，发病鳄精神状态好转，开始恢复食欲，能进食少量活鲫鱼，开始正常活动，吼叫声音清晰洪亮，背皮颜色恢复成黑色，与健康的同类肤色基本一致，2周后与其他健康鳄鱼基本相似，饲养员认为已痊愈。

3　讨论

根据发病暹罗鳄临床症状，分离菌形态、培养特性、生化试验、分离菌16S rDNA序列的同源性比对结果，以及致病性特点，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》[3]，可以判定从该病死鳄肝、心血、肺组织中分离的细菌为毒力很强的致病性大肠杆菌。药敏试验表明，分离大肠杆菌对临床上习惯选用的头孢类及沙星类抗生素已产生耐药，这可能是该鳄鱼馆长期使用头孢类药物治疗效果不佳的原因所在，而选用敏感的阿米卡星进行治疗，很快收到了理想的治疗效果，说明临床在治疗鳄鱼大肠杆菌病时，必须根据药敏试验结果进行合理选择，以减少耐药菌株的形成，亦不延误治疗。

鳄鱼大肠杆菌病报道较少，本文初次从西南地区人工养殖的发病暹罗鳄内脏组织中分离到该致病菌的存在，其生化特征、药物敏感性与其他地区鳄鱼大肠杆菌病报道[4]存在一定差异，其血清型、毒力强弱、流行特点等有待深入研究。大肠杆菌作为一种条件性致病菌，强化饲养管理，提高鳄鱼自身的免疫抗病能力，同时做好鳄鱼生活场所及水体的定期消毒，是有效控制本病的关键，特殊是西南地区的春秋季节，水中落叶较多，气候潮湿，沟渠流水偏少，树叶腐败，水体污染，细菌大量繁殖，是本病的高发季节。

[1]刘洋，王玉田，杨龙峰，等.北京某鸭场鸭疫里默氏菌与大肠杆菌混合感染的诊治[J].中国兽医杂志，2014，50（1）：32-33.

[2]中华人民共和国卫生部.WS/T 125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准[S].北京：中国标准出版社，2000.

[3]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京：科学出版社，1984：146-189，238-432.

[4]陈俊敏，杨珊，赵伟，等.一例鳄鱼沙门菌与大肠杆菌混合感染的诊治[J].畜牧兽医科技，2007，（32）5：22-23.

S852.61文献标志码：B

0529-6005（2016）07-0103-02

205-08-26

赵川（1990-），男，硕士生，主要从事基础兽医学及临床疾病防治研究，E-mail：510390483@qq.com

黄庆洲，E-mail：hqzrc@126.com