李军朝，邸　涛，陈　静，刘慧谋，张信军，王彦红，3

（1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；3.江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州 225009）

1株鹦鹉源多杀性巴氏杆菌的鉴定

李军朝1，2，邸涛1，2，陈静1，2，刘慧谋1，2，张信军1，2，王彦红1，2，3

（1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；3.江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州 225009）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）属于革兰阴性球杆菌，定居于家禽和野禽的鼻咽部，能引起宿主出血性败血症，发病率和死亡率都很高，但不同类型的家禽易感性不同。多杀性巴氏杆菌有5个荚膜血清型，分别为A、B、D、E和F，引起禽类动物的多杀性巴氏杆菌荚膜血清型多为A型[1]。此外，有较多技术对多杀性巴氏杆菌进行分型，其中多位点序列分型技术（multilo⁃cus sequence type analysis，MLST）自2010年在禽源多杀性巴氏杆菌开展研究以来迅速发展[2]。本试验从1只死亡的鹦鹉脏器中分离到1株多杀性巴氏杆菌，并对其荚膜血清型和序列型进行鉴定。

1　材料与方法

1.1材料绵羊血平板、麦康凯琼脂培养基按通用的组方自行配制。其中麦康凯琼脂粉，购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司；琼脂粉与氯化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨与胰酶，购自OXOID公司；绵羊血、肠杆菌科细菌生化管和药敏试纸，购自杭州天和微生物试剂有限公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit以及荚膜血清型鉴定所需的试剂，均购自TaKaRa公司；本试验用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2细菌分离2014年9月，扬州大学动物医院接到1例鹦鹉突然死亡的病例，该鹦鹉死亡之前有轻微垂翅现象，排白绿色粪便，无其他表现。临床检查发现鹦鹉肛门附近羽毛沾有少量粪便。剖检可见胸肌淤血，肝脏肿大。无菌条件下用接种环挑取肝脏和心脏部分组织于绵羊血琼脂平板上，置于37℃培养24 h，观察结果。24 h后挑取绵羊血琼脂平板上的单个菌落分别接种于麦康凯平板和绵羊血琼脂平板上，置于37℃培养24 h，观察结果。

1.3生化试验采用微量生化反应管对分离到的菌株进行生化指标的鉴定，置于37℃培养24 h后观察试验结果。

1.416S rDNA基因序列分析根据文献记载的煮沸裂解法[3]制取细菌DNA，然后按照TaKaRa公司16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit说明标准对模版进行PCR扩增，得到500 pb大小的酶切DNA片段后进行1%琼脂糖凝胶电泳，得到目的条带后切胶测序，结果与NCBI数据库（http：//www. ncbi.nlm.gov/BLAST）进行数据比对，鉴定所属菌种。

1.5荚膜血清型鉴定根据Townsend等描述的方法[4]，应用特异性基因引物capA对1.4中细菌DNA进行PCR，产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并用已知的细菌作为阳性对照[5]。

1.6多位点序列分析采用多杀性巴氏杆菌的7个管家基因（adk，est，pmi，zwf，mdh，gdh和pgi）进行多位点序列分析[2]。PCR引物、PCR反应组成和反应条件等均参考P.multocida RIRDC MLST（http：//pubmlst. org/pmultocida_rirdc/）的数据，扩增产物经电泳鉴定后，切胶送于上海生工生物工程技术服务有限公司测序。序列经上传后（http：//pubmlst.org/pmultoci⁃da_rirdc/）获取相关的ST。

1.7药敏试验采用纸片琼脂扩散法进行药敏试验，药敏片的规格为头孢曲松钠（30 μg/片）、氧氟沙星（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、丁胺卡那霉素（30 μg/片）、复方新诺明（23.75 μg/片）、痢特灵（300 μg/片）、美洛西林（75 μg/片）、多粘菌素B （300 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、庆大霉素（10 μg/片）、强力霉素（30 μg/片）、链霉素（10 μg/片）、妥布霉素（10 μg/片）、氟苯尼考（30 μg/片）、新霉素（30 μg/片）。药敏结果判定按照杭州天和微生物试剂有限公司发布的标准进行。

2　结果

2.1细菌分离血平板上分离出无色露珠状的、均匀的半透明菌落，该菌在麦康凯培养基上不生长。镜检可见分离菌为革兰阴性的小杆菌。

2.2生化鉴定生化鉴定如表1所示，生化鉴定表明，该菌可发酵葡萄糖、果糖、乳糖、木糖，甘露醇，硝酸盐还原阳性，符合多杀性巴氏杆菌的生化特点。

表1　细菌分离株生化鉴定

2.316S rDNA基因序列分析分离菌用16S rDNA试剂盒扩增后，经琼脂糖凝胶电泳后，出现约500 bp的目的片段，切胶后测序，结果在NCBI网站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST搜索比对后，与数据库的多杀性巴氏杆菌同源性100%。

2.4荚膜血清型测定如图1所示：分离菌经PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳后，出现约1 000 bp的目的片段，因此，该菌株应为荚膜血型A型。

2.5MLST结果分离菌分别以adk，est，gdh，mdh，pgi，pmi和zwf2引物进行PCR，结果各出现约570、641、702、620、784、739 bp和614 bp条带，目的片段切胶测序，结果上传数据库（http：//pubmlst. org/pmultocida_rirdc/），获得相应的等位基因序列号，分离菌的7个等位基因序列号est，mdh，pgi，pmi，adk，gdh和zwf分别是33，17，20，26，21，20和2，因此，ST型为129。

图1　用PCR进行荚膜血清分型

2.6药敏试验药敏试验显示，该菌复方新诺明和强力霉素耐药；对庆大霉素等药物都呈高度敏感或中度敏感；结果如表2所示。

表2　分离菌株的药敏试验结果

3　讨论

3.1根据分离菌株的生长特点、生化特性和16S rDNA序列分析可知从病死鹦鹉体内分离出的1株多杀性巴氏杆菌，其序列型为ST129。根据MLST数据（http：//pubmlst.org/pmultocida/）最新数据可知，ST129是江苏地区禽源多杀性巴氏杆菌的已知的惟一基因型[6]，已研究显示在鸡、鸭和鹅等家禽分离菌株为此基因型，但在鹦鹉上是首次分离到多杀性巴氏杆菌，研究表明其能在动物体内通过各种方式感染人[7]，因此，饲养过程中要注意一些鸟类携带或感染多杀性巴氏杆菌从而感染人。

3.2分离菌株生化结果显示，该细菌除具有多杀性巴氏杆菌发酵葡萄糖和硝酸盐还原阳性共性之外，该细菌还能发酵麦芽糖，此特点与已知文献有差异[1]。

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S858.39文献标志码：B

0529-6005（2016）07-0033-02

2015-03-04

江苏高校优势学科建设工程资助项目；江苏省人兽共患病学重点实验室资助项目（R1406）

李军朝（1989-）,男,硕士生,主要从事临床兽医学的研究工作，E-mail：june5210@163.com

王彦红，E-mail：wyh7405@163.com