李　琪，李华涛，丛　霞，姜忠玲，曹荣峰，田文儒

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

稳定转染高表达HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮细胞系的建立

李琪，李华涛，丛霞，姜忠玲，曹荣峰，田文儒

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

为了建立稳定表达HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮细胞系，本试验应用PCR法扩增HSP72基因，插入真核表达质粒EGFP-N2中构建EGFP-N2-HSP72重组质粒。以脂质体介导的方法将其转染于奶牛乳腺上皮细胞，经G418筛选后获得稳定表达HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮细胞，并且转染的HSP72基因序列正确。阴性对照组EGFP-N2的奶牛乳腺上皮细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光，且重组质粒组极显著（P<0.01）表达HSP72蛋白。表明成功构建了EGFP-N2-HSP72真核表达载体，并建立了高表达HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮细胞系。

HSP72；稳定转染；真核表达；奶牛乳腺上皮细胞

奶牛乳腺炎是奶牛乳腺受到微生物及理化因素刺激所发生的炎性变化，是奶牛多发性疾病，给奶牛业造成严重经济损失，危害奶业发展。大量人类医学报道热休克蛋白（HSP）70表达增加有明显的抗炎症作用[1]。我们实验室前期研究表明，LPS诱导体外培养的牛乳腺上皮细胞炎症反应中，HSP72呈现高表达。诱导型HSP72在大鼠肝脏热缺血再灌注中抑制肝脏NF-肝脏活性，减轻肝脏炎症反应[2]。如上，HSP72能抑制NF-72活性，通过细胞内NF-通过调节机制来参与应激保护作用，减轻细胞的损伤。因此研究HSP72高表达对炎症反应具有重要的意义。本试验旨在建立稳定表达HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮细胞系，为进一步研究乳腺炎中HSP72蛋白调节炎症的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1奶牛乳腺上皮细胞系本实验室鉴定并保存。

1.2主要试剂pMDTM18-T载体克隆试剂盒、限制性内切酶HindⅢAccⅠ，购自大连TaKaRa公司；质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；E.coli DH5α、G418，购自北京全式金生物技术有限公司；Lipofectami⁃neTM3000，购自Invitrogen公司；HSP72抗体，购自Santa cruz公司，二抗，购自Jackson ImmunoResearch公司。

1.3扩增牛HSP72基因及产物回收收集<107悬浮细胞于1.5 mL离心管，按组织细胞RNA快速提取试剂盒说明提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增HSP72基因。牛HSP72引物（GenBank Acc：BC103083）设计加入HindⅢ和AccⅠ酶切位点，上游引物：5′-GAGCTCAAGCTTC ATGGC⁃GAAAAACATGG-3′；下游引物：5′-GGTATCGTC⁃GACA TAATCCACCTCCTCAATG-3′。cDNA 0.1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，Ex Taq聚合酶0.4 μL，10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，50μL体系。95℃5 min，95℃1 min，60℃45 s，72℃2.5 min，30 s，72℃10 min。PCR鉴定后切取HSP72条带，按胶回收试剂盒说明洗脱DNA。

1.4EGFP-N2-HSP72真核表达载体的构建与鉴定将洗脱DNA连接pMD18-T载体，转化至DH5α感受态细胞扩增培养阳性克隆，将测序验证的阳性克隆菌液提取18-T-HSP72质粒，HindⅢ和AccⅠ双酶切18-T-HSP72及EGFP-N2载体37℃温育5 h。回收HSP72片段和酶切的EGFP-N2用T4 DNA连接酶于16℃水浴连接过夜。产物转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌液进行PCR鉴定。

1.5稳定转染HSP72基因的奶牛乳腺上皮细胞系建立按质粒大提试剂盒说明提取质粒DNA。每孔0.25～1×106个细胞接种于6孔板中，待细胞汇合度达70%～90%，每孔加2 mL Opti-MEM培养基对细胞进行饥饿处理1 h，用Opti-MEM分别稀释转染试剂Lipofectamine 3000和重组质粒DNA静置5 min，将二者混匀静置20 min后加入6孔板，于37℃温箱孵育6 h，去除转染液加入含10%FBS的DMEM-F12培养基培养24～48 h，在488 nm波长激发光下，荧光显微镜观察EGFP-N2表达情况，再换用G418培养基筛选2周得到稳定表达HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮细胞系。

1.6奶牛乳腺上皮细胞系中HSP72蛋白表达鉴定

收集转染EGFP-N2-HSP72组、EGFP-N2组及正常组奶牛乳腺上皮细胞，提取总蛋白，加热变性进行凝胶电泳，转膜2 h，再封闭2 h，按顺序加入羊抗牛HSP72（1∶1 000）、兔抗羊IgG-HRP（1∶3 000）孵育，显色后拍照鉴定。

2　结果与分析

2.1PCR扩增HSP72基因结果各样品用含酶切位点的引物均扩增出了同预期一致特异性片段，经扩增HSP72基因片段约1 951 bp（图1）。

图1　HSP72基因扩增

2.2连接18-T载体后单菌落PCR鉴定、测序与酶切鉴定PCR产物与18-T连接，阳性菌液PCR显示4个HSP72基因片段均约为1 951 bp，同预期结果一致（图2），测序结果表明，HSP72序列与GenBank中奶牛HSP72基因序列相同，进一步表明扩增出了正确的HSP72基因片段。

图2　连接18-T载体HSP72基因单菌落PCR鉴定

限制性内切酶HindⅢ和AccⅠ双酶切pMD 18-T-HSP72质粒，出现预期大小的两条条带，HSP72为1 925 bp，pMD 18-T为2 692 bp（图3），说明18-T载体构建正确。

图3　pMD 18-T-HSP72质粒双酶切鉴定

2.3真核表达载体EGFP-N2-HSP72菌液PCR鉴定与测序EGFP-N2-HSP72菌液进行PCR鉴定，出现的片段约为1 925 bp，同预期结果一致（图4），测序结果表明，HSP72序列与GenBank中奶牛HSP72基因序列相同，表明载体构建正确。

2.4稳定转染细胞系的筛选将测序正确的载体单克隆摇菌，提取EGFP-N2-HSP72质粒转染于奶牛乳腺上皮细胞G418后，倒置荧光显微镜下观察阴性对照EGFP-N2呈绿色荧光（图5）。

图4　真核表达载体EGFP-N2-HSP72阳性单菌落鉴定

图5　转染空载体EGFP-N2的奶牛乳腺上皮细胞

2.5稳定转染后奶牛乳腺上皮细胞中HSP72蛋白的检测各组细胞均有HSP72和内参蛋白两条条带（图6）。与正常细胞组和空载体EGFP-N2组比，EGFP-N2-HSP72组HSP72蛋白的表达量极显著（P<0.01）增加（图7）。

图6　各组细胞HSP72蛋白SDS-PAGE凝胶电泳结果

图7　免疫印迹检测奶牛乳腺上皮细胞HSP72蛋白表达

3　讨论与结论

热休克蛋白（HSPs）是细胞受到应激后产生的一类蛋白质，HSP70是HSPs家族中最主要的，被认为是整个进化中最保守的蛋白之一[2]。HSP72（诱导型HSP70）由于在正常细胞很少甚至不表达，而应激时却明显增加，因此，HSP72是目前国内外该研究中最深入的一种[3]。

HSP72的表达与多种炎性疾病有关，能够抑制致炎因子和诱导抗炎因子，以减轻对组织细胞的炎症反应。重组HSP72能诱导抗炎细胞因子IL-10生成，从而发挥抗炎效应[4]。细胞外HSP72通过下调类风湿关节炎滑膜细胞IL-6、IL-8产生和分泌及抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用[5]。

本研究采用G418作为稳定转染中的抗性筛选试剂[6]，转染载体携带HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮细胞可在含G418的培养基中存活[7]。由于正常组未转染任何载体，在G418筛选时细胞大部分被杀死，所以阴性对照组HSP72蛋白显著升高[8]。倒置荧光显微镜下转染空载体EGFP-N2的细胞可见绿色荧光标记，表明成功将HSP72基因转染于奶牛乳腺上皮细胞，稳定转染EGFP-N2-HSP72组HSP72蛋白表达量极显著升高，表明HSP72蛋白高表达。

综上所述，本研究成功构建了真核表达载体EGFP-N2-HSP72并建立了稳定表达HSP72蛋白的奶牛乳腺上皮细胞系，为进一步研究牛乳腺炎中HSP72蛋白调节炎症的分子机制奠定基础。

[1]郭辉，王少刚，余建华.慢性前列腺炎患者精浆中热休克蛋白的表达及临床意义[J].中华泌尿外科杂志，2004，25（6）：411-413.

[2]陈皓，邱伟华，邓侠兴，等.大鼠肝脏热缺血再灌注损伤中HSP72对肝细胞的保护作用[J].中国微循环，2006，10（5）：318-321.

[3]Morteza A，Nakhjavani M，Larry M，et al.Heat shock protein 70 and albuminuria in patients with type diabetes a matched case control study[J].Cell Stress Chaperones，2013，18（6）：815-819．

[4]朱冬芳，晏春根，黄丹文.重组热休克蛋白72对体外培养大鼠肝细胞脂肪变性的影响[J].中华全科医学，2014，12（6）：850-852.

[5]Van Eden W，Zee R，Prakken B.Heat shock proteins induce T-cell regulation of chronic inflammation[J].Nat Rev Immunol，2005，5（4）：318-330.

[6]罗心静，莫选荣，周玲玲.Hsp72对类风湿关节炎滑膜细胞IL-6表达及NF-κB活化的影响[J].中国应用生理学杂志，2012，28（4）：336-339.

[7]蒋玲琳，刘丽，朱含章，等.稳定表达GlyRα1的HEK293细胞系的建立[J].南京医科大学学报（自然科学版），2007，27 （7）：647-650.

[8]Chen H X，Wang S，Wang Z，et al.Overexpression of RUNX3 in⁃hibits malignant behaviour of Eca109 cells in vitro and vivo[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（4）：1531-1537.

[9]Collet G，Lamerant-Fayel N，Tertil M，et al.Hypoxia-regulated overexpression of soluble VEGFR2 controls angiogenesis and in⁃hibits tumor growth[J].Mol Cancer Ther，2014，13（1）：165-178.

Establishment of BovineMammary Epithelial Cell Linewith StableTransfection and High Expression HSP72 Protein

LI Qi，LI Hua-tao，CONG Xia，JIANG Zhong-ling，CAO Rong-feng，TIAN Wen-ru
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

In order to establish a stable bovine Mammary Epithelial Cell（bMEC）line expressing HSP72 protein，HSP72 gene was amplified by PCR and inserted into the eukaryotic expression plasmid EGFP-N2to construct the recombinant plasmid EGFPN2-HSP72.Liposome-mediated method was used to transfect it into bMEC.After selecting by G418，the stable bMEC line expres⁃sion HSP72 protein was obtained.Negative control plasmid EGFP-N2 of bMEC showed green fluorescence under a fluorescence mi⁃croscope，and the recombinant plasmid had a very significant high expression of HSP72 protein.Here，we successfully constructed an EGFP-N2-Hsp72 eukaryotic expression vector，and established a bMEC line with high expression of HSP72 protein.

HSP72；Stable transfection；Eukaryotic expresson；Cow mammary epithelial cells

TIAN Wen-ru

S823

A

0529-6005（2016）07-0003-03

2015-05-25

国家自然科学基金（31172378，31572590）；山东省农业技术体系创新团队（SDAIT-12-011-03）

李琪（1988-），女，硕士，主要从事基因蛋白检测研究，E-mail：liqi991@qq.com

田文儒，E-mail：wrtian@126.com