于非非，余祥勇，潘珍妮，宋娜娜，王梅芳

（广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088）



企鹅珍珠贝Creb2基因的克隆及表达分析

于非非，余祥勇，潘珍妮，宋娜娜，王梅芳

（广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088）

CREB（cAMP response element binding protein）是一种真核生物中广泛存在的调控因子。为了探讨企鹅珍珠贝（Pteria penguin）Creb基因的序列和表达特征，为进一步阐述Creb的生理功能提供科学依据，本研究利用RACE-PCR技术克隆到企鹅珍珠贝一个Creb基因的全长序列，分析其理化性质和进化地位；利用荧光定量PCR分析Creb基因在各组织中的表达特征。结果表明，该企鹅珍珠贝Creb基因的cDNA全长为1484 bp，其中开放阅读框（ORF）为1071 bp，编码356个氨基酸，5′非编码区为218 bp，3′非编码区为 195 bp，C端包含一个碱性亮氨酸拉链结构（basic region leucin zipper，bZIP）。预测其分子质量为39.49 kD，等电点为4.43。序列比对显示该企鹅珍珠贝Creb基因与欧洲平牡蛎（Ostrea edulis）和太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的Creb2同源性（identity）最高，分别为46.3%和46.1%，故命名为ppCreb2；系统进化树分析结果与传统形态学分类结果相吻合。荧光定量PCR分析显示，ppCreb2在企鹅珍珠贝的各个组织中组成性表达，其中在足中表达量最高，鳃中其次。

企鹅珍珠贝；ppCreb2；基因克隆；表达分析；荧光定量PCR

doi：10.11759/hykx20150824001

CREB（cAMP response element binding protein）即环磷酸腺苷反应元件结合蛋白，是真核生物中广泛存在的一种细胞核内调控因子，通过自身磷酸化实现转录功能的调控［1］。CREB家族蛋白的C端都包含大量碱性氨基酸和一个亮氨酸拉链，被称为碱性亮氨酸拉链结构域 （basic region leucin zipper，bZIP）［2］，这一结构域的DNA亲和力很高，能以二聚体的形式与靶基因启动子中的CRE（cAMP response element）位点结合，调控下游多个基因的转录活性，是CREB家族蛋白最保守的区域。作为一种重要的转录调控因子，CREB家族蛋白参与了细胞的增殖［3］、分化［4］和凋亡［5］，学习记忆［6］，精子发生［7］和肤色决定［8］等多种复杂的生命活动。根据结构和功能的不同，CREB家族被划分为CREB1、CREB2、CREB3和CREB3L4（CREB3-like4）四个亚族。近年来，已在节肢动物［9］、腔肠动物［10］、鱼类［11］、鸟类［12］和哺乳动物［7］等几十个物种中克隆到Creb基因，但在双壳类中研究较少［13］。

企鹅珍珠贝（Pteria penguin）属于软体动物门（Mollusca），瓣鳃纲（Lamellibranchia），翼形亚纲（Ptermorphia），珍珠贝目（Pterioida），珍珠贝科（Pteriidae）［14］。企鹅珍珠贝个体大、生长快、成活率高，其突出特点是分泌珍珠质机能旺盛、珠层厚、色泽奇异，是我国目前唯一能规模养殖的大型珍珠贝，被认为是最具有“振兴南珠”潜能的品种［15］。作为一种调控因子的Creb基因是否也存在于企鹅珍珠贝中，是否参与了企鹅珍珠贝重要生命活动的调控是值得探索的问题。

本研究建立了企鹅珍珠贝全组织的转录组数据库，利用RACE-PCR技术克隆到企鹅珍珠贝Creb2基因的cDNA全长序列，构建系统进化树分析该基因的进化地位；利用荧光定量PCR技术分析Creb2基因在企鹅珍珠贝各组织中的表达差异，旨在为进一步阐述Creb2在企鹅珍珠贝各种生理过程中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用企鹅珍珠贝采自广东省湛江市雷州市流沙湾养殖群体，体重300～350 g。

1.2 主要试剂

实验所用主要试剂包括SMARTer®RACE 5′/3′Kit （Clontech）、 UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（上海生工）、 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）、 E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒（Omega）、SYBR Select Master Mix（Life technologies）、LA taq（Takara）、PMD18-T（Takara）、琼脂糖（Agarose）等。DEPC、氨苄青霉素等其他试剂为国产分析纯，DH5α感受态细胞购自全式金。

1.3 企鹅珍珠贝Creb全长cDNA的克隆

分别提取企鹅珍珠贝的外套膜、鳃、闭壳肌、消化盲囊、足、精巢、卵巢的RNA，将各组织RNA混合后应用Illumina测序技术进行转录组测序，建立了企鹅珍珠贝全组织的转录组数据库，并进行生物信息学分析。

利用企鹅珍珠贝各组织混合 R N A，按照SMARTer®RACE 5′/3′Kit说明书合成企鹅珍珠贝Creb的3′RACE模板和5′RACE模板。根据企鹅珍珠贝转录组数据库中注释为Creb的unigene序列设计企鹅珍珠贝Creb基因3′RACE的特异性引物Creb-3-F和5′RACE的特异性引物Creb-5-R（表1），3′RACE和5′RACE PCR反应体系为2×SeqAmp Buffer 25 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1 μL，5′RACE或3′RACE cDNA模板（100 ng/µL）2.5 μL，10×UPM（Universal Primer Mix，0.2µmol/L）5 μL（表1），Creb-3-F或Creb-5-R（10µmol/L）1 μL，PCR-Grade H2O 15.5 μL。使用touch-down PCR程序扩增：94℃30 s，72℃2 min，5个循环；94℃30 s，70℃30 s，72℃ 2 min，5个循环；94℃30 s，68℃30 s，72℃2 min，25个循环。PCR产物经电泳分离、纯化，与RACE试剂盒中的 Lineareized pRACE vector连接，转化进DH5α感受态细胞中培养过夜，筛选阳性克隆进行测序。经测序后3′RACE序列和5′RACE序列进行拼接，并利用 VecScreen软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html）去除载体序列，获得企鹅珍珠贝Creb基因的电子全长。

根据Creb基因的电子全长，设计特异引物Creb-cDNA-F和Creb-cDNA-R（表1），利用LA taq酶克隆Creb基因全长cDNA。PCR产物与PMD18-T载体连接、转化、培养，筛选阳性克隆测序以验证电子全长序列的正确性。

1.4 目的基因的生物信息学分析

通过ORF Finder工具，推导企鹅珍珠贝Creb基因编码的氨基酸序列；通过 Expasy网站（http：// web.expasy.org/compute_pi/）分析其相对分子质量和等电点；经ProtScale软件分析氨基酸序列的疏水性；经SignalP 4.1、TMHMM和NetOGlyc 4.0分别预测其信号肽、跨膜结构及糖基化位点；经SMART对其进行结构预测和功能分析；利用Clustal X（1.8）软件将获得的企鹅珍珠贝Creb基因与其他物种的Creb基因编码氨基酸进行同源比对，用MEGA6软件构建系统进化树。

1.5 荧光定量PCR检测目的基因的组织表达

分别提取企鹅珍珠贝外套膜、鳃、闭壳肌、消化盲囊、足、精巢和卵巢的RNA，反转录合成第一链cDNA，进行荧光定量PCR检测。以β-actin基因作为内参，以企鹅珍珠贝的闭壳肌为对照，采用2-ΔΔCt法计算Creb基因在不同组织中的表达水平，每组设3个重复，组间重复性和差异显著性用SPSS16.0分析。

2 结果与分析

2.1 企鹅珍珠贝Creb基因的克隆和序列分析

采用5′RACE技术获得了1169 bp的Creb 5′序列，采用3′RACE技术获得了678 bp的Creb 3′序列，拼接后获得1484 bp的Creb全长序列。利用CrebcDNA-F和Creb-cDNA-R引物进行PCR验证，获得1328 bp序列，与我们拼接的Creb基因全长序列相吻合。企鹅珍珠贝Creb基因cDNA全长为1484 bp，其中开放阅读框（ORF）为1071 bp，编码356个氨基酸，5′非编码区为218 bp，3′非编码区为 195 bp，包含30 bp 的polyA尾巴，如图1所示。登录号为KT388104。

图1 企鹅珍珠贝Creb基因序列分析Fig.1 Creb cDNA and deduced amino acid sequences of Pteria penguin小写字母代表非编码序列（UTR）；大写字母代表开放阅读框（ORF），灰色框代表碱性亮氨酸拉链结构域（276～341 bp）5′UTR and 3′UTR regions are shown in small letters；open reading fragment is shown in capital letters；basic region leucin zipper（bZIP）is shown in gray box（276-341 bp）

2.2 CREB蛋白理化性质预测和分析

经Expasy预测企鹅珍珠贝CREB蛋白分子质量为39.49 kD，等电点为4.43。ProtScale分析疏水性显示，该蛋白的疏水指数从-3.678至2.2，属于亲水性蛋白，约在第164位表现出最强的疏水性，第298位表现出较出最强的亲水性（图2）。经TMHMM 2.0进行跨膜结构域预测，显示没有跨膜区。SignalP4.1预测其不存在信号肽，属于非分泌型蛋白。NetOGlyc4.0分析发现其有3个糖基化位点，分别是第22位、第26位和第108位。SMART软件分析发现，企鹅珍珠贝CREB蛋白的N端富含天冬氨酸（Asp，D）和谷氨酸（Glu，E）等酸性氨基酸，C端富含赖氨酸（Lys，K）和精氨酸（Arg，R）等碱性氨基酸，包含一个典型的碱性亮氨酸拉链结构域（basic region leucin zipper，bZIP）（图1和图3）。

图2 企鹅珍珠贝CREB蛋白的疏水性预测Fig.2 Hydrophobicity prediction of CREB in Pteria penguin“+”代表疏水值，“-”代表亲水值+hydrophobicity；-hydrophobicity

图3 企鹅珍珠贝CREB蛋白质结构预测Fig.3 Prediction of CREB structure in Pteria penguin

2.3 CREB氨基酸序列同源性分析

采用Clustal X软件将企鹅珍珠贝的Creb基因与其他物种的Creb基因编码氨基酸进行多序列比对，结果显示，该基因与欧洲平牡蛎（Ostrea edulis，ADG85255.1）和近江牡蛎（Crassostrea ariakensis，BQ59345.1））的Creb2基因同源性（identity）最高，分别为46.3%和46.1%；与人（Homo sapiens，AAA52071.1）、小鼠（Mus musculus，NP_033846.2）和墨西哥脂鲤（Astyanax mexicanus,XP_007231405.1）的Creb2基因同源性其次，分别为为26.3%、25.7%和24.6%。其中，保守位点主要集中在碱性亮氨酸拉链结构域（图4）。因此将该企鹅珍珠贝Creb基因命名为ppCreb2。

分别选取近江牡蛎、欧洲平牡蛎、光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata，ACZ51334.1）creb、静水椎实螺（Lymnaea stagnalis，BAC21159.1）、海兔（Aplysia californica，NP_001191630.1）和墨西哥脂鲤等物种的Creb2基因编码的氨基酸进行聚类分析，如图 5 Neighbor-joining（NJ）树所示：企鹅珍珠贝、太平洋牡蛎和欧洲平牡蛎都属于软体动物瓣鳃纲，其Creb2编码氨基酸聚为一个小的进化分支；光滑双脐螺、静水椎实螺和海兔属于软体动物腹足纲，聚为一个小的进化分支；以上所有的软体动物聚为一个大的进化分支，而墨西哥脂鲤这一外群物种单独列为一个进化分支。CREB2聚类结果与传统的进化分类学相吻合，印证了双壳类瓣鳃纲和腹足纲动物的亲缘关系。

图4 企鹅珍珠贝与其他物种Creb2基因编码氨基酸比对Fig.4 Amino acid alignment of Creb2 in Pteria penguin and other homologues相同的氨基酸以涂黑表示The amino acids showing100%identity are marked with black box

图5 企鹅珍珠贝与其他物种Creb2氨基酸序列的系统进化树（NJ）Fig.5 Phylogenetic tree of Creb2 from Pteria penguin and other homologues

2.4 Creb2基因的组织定量分析

采用荧光定量PCR分析Creb2基因在企鹅珍珠贝各个组织中的表达水平，结果显示（图6），从RNA水平看，ppCreb2基因在企鹅珍珠贝各个组织中都有表达，但表达量有所差异。在足中表达量最高，其次是鳃，在外套膜、闭壳肌、精巢和卵巢中的表达量较低。

图6 ppCreb基因在企鹅珍珠贝各组织的表达水平Fig.6 Expression of ppCreb in different tissues of Pteria penguinM.外套膜；G.鳃；AM.闭壳肌；DD.消化盲囊；F.足；T.精巢；O.卵巢M：mantle；G：gill；AM：adductormuscle；DD：digestive diverticulum；F：foot；T：testis；O：ovary

3 讨论

1986年，Montrminy等［1］发现许多基因都受cAMP的调控，这些基因的共同特点是启动子和增强子序列中含有一段高度保守的5′-TGACGTCA-3′序列，并命名为cAMP反应元件（cAMP response element，CRE）。随后，他们又分离纯化到一种特异性结合CRE的核蛋白，命名为cAMP应答元件结合蛋白（cAMP response element binding protein）即CREB蛋白［16］。CREB蛋白家族主要包括CREB1、CREB2、CREB3和CREB3L4四个成员。CREB2（cyclic AMP response element binding protein 2），也称ATF4（activating transcription factor 4），是内质网应激通路中的信号转导蛋白，由PERK/elF2α通路中磷酸化的elF2α激活［17］。

本研究从企鹅珍珠贝cDNA文库中克隆了Creb基因全长序列。同源性分析显示，企鹅珍珠贝Creb基因与欧洲平牡蛎Creb2基因具有最高的同源性，为46.3%。结构分析发现，企鹅珍珠贝Creb基因编码氨基酸分为N端和C端两个结构域，其N端富含酸性氨基酸，为酸性激活区域；C端为保守的碱性亮氨酸结构域。不含KID区（激酶诱导结构域），为非跨膜蛋白，这些特点与大多数动物经典的CREB2蛋白结构相似［18-19］。其中N端主要行使转录激活功能，C端主要行使DNA结合和蛋白二聚体化的功能。因此，我们将该企鹅珍珠贝Creb基因鉴定为ppCreb2。这说明Creb2基因在各个物种中是相对保守的，也暗示了ppCreb2基因在贝类的生命活动中起到重要作用。

作为一种重要的转录因子，CREB2参与了多种生命过程。对海兔和果蝇的研究发现，CREB2可抑制记忆贮存和突出可塑性，是一种记忆抑制基因［20-21］。CREB2参与了小鼠造骨细胞早期分化和末期分化，对维持造骨细胞的分化和功能至关重要，CREB2缺陷小鼠出现小眼症状表型［4］。CREB2也可参与内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress），调节内质网内稳态体系［22］。还可与多种病毒蛋白相互作用，调节与之结合的病毒蛋白的表达水平［23］。

与CREB2广泛的生理功能相一致的，Creb2在各个组织中普遍表达。对猪的研究发现，Creb2在白色脂肪组织、胃、肾肺、小脑、肝脏和淋巴组织中表达量较高，在心脏和肌肉中表达量较低［24］。我们的研究发现，ppCreb2基因在企鹅珍珠贝足中表达量最高，这可能与Creb2在神经系统中大量表达相一致［20］。作为进化地位比较低的软体动物，其神经系统主要由4对神经节和与之联络的神经构成，其中重要的一对神经节足神经节1就位于足的前部［25］。另外，ppCreb2基因在鳃中表达量也很高。贝类通过鳃直接与水环境接触，营呼吸功能，接触大量病毒和细菌，在鳃中大量表达印证了CREB2蛋白可与多种病毒蛋白相互作用这一功能。因此，我们推测CREB2在企鹅珍珠贝多种生命活动中起到重要作用。

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（本文编辑：康亦兼）

Molecular cloning and expression analysis of Creb2 gene from Pteria penguin

YU Fei-fei,YU Xiang-yong,PAN Zhen-ni,SONG Na-na,WANG Mei-fang

（Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

Aug.22，2015

Pteria penguin；ppCreb2；Gene cloning；expression analysis；real-time PCR

In this study，in order to analyze the sequence and expression characteristics of the cAMP response element binding protein（Creb）gene in the Pteria penguin，we characterized the full-length cDNA of the Creb gene from the Pteria penguin by the rapid amplification of cDNA ends（RACE）-polymerase chain reaction（PCR）.We then used real-time PCR to examine the expression of Creb in different tissues.The results show that the full-length cDNA of Creb was 1484 bp，including a 5＇UTR of 218 bp，a 3＇UTR of 195 bp，and an open-reading frame of 1071 bp，which encodes a deduced protein of 356 amino acids.The C-terminal region contained a conserved basic region leucin zipper（bZIP）.The predicted molecular weight was 39.49 kD，and the isoelectric point was 4.43.The sequence comparison showed that Creb in the Pteria penguin（ppCreb2）shares 46.3%and 46.1%sequence identities with Creb2 in Ostrea edulis and Crassostrea gigas，respectively.The phylogenetic analysis results were consistent with traditional taxonomic analysis.The real-time PCR showed that ppCreb2 was constitutively expressed in all studied tissues（mantle，gill，adductor muscle，digestive diverticulum，foot，testis，and ovary），with higher levels in the foot and gill.

Q341

A

1000-3096（2016）05-0029-07

2015-08-22；

2015-10-20

广东海洋大学优秀青年骨干教师培养项目（20140040）；广东海洋大学博士启动基金（E15041）；广东省海洋渔业科技推广专项项目（A201308A11）

［Foundation：the Outstanding Young Teacher Foundation of Guangdong Ocean University，No.20140040；Doctoral research project of Guangdong Ocean University，No.E15041；the Technology Extension Foundation of Marine Fishery in Guangdong Province，No.A201308A11］

于非非（1980-），女，山东威海人，讲师，博士，从事贝类分子遗传育种的研究，电话：0759-2383504，E-mail：yufeifei2000@163.com；王梅芳，通信作者，教授，E-mail：pearlang@126.com