董志兵　陈云鹏浙江省温岭市第一人民医院心血管内科，浙江温岭　317500

抗IL-22抗体对IL-17A基因敲除小鼠病毒性心肌炎的影响

董志兵陈云鹏
浙江省温岭市第一人民医院心血管内科，浙江温岭317500

目的将IL-17A基因敲除病毒性心肌炎小鼠腹腔内注射抗IL-22抗体，探讨抗IL-22抗体对IL-17A基因敲除小鼠病毒性心肌炎的影响。方法将18只小鼠分为抗IL-22抗体组、病毒性心肌炎组和对照组，抗IL-22抗体组和病毒性心肌炎组小鼠建立病毒性心肌炎小鼠模型，建模当天抗IL-22抗体组小鼠腹腔内注射抗IL-22抗体50μg，病毒性心肌炎小鼠腹腔内注射等体积PBS液，对照组小鼠不做任何处理。观察建模2周时各组小鼠心肌Nancy株柯萨奇病毒的复制情况、心肌炎性因子表达情况和血清IL-22蛋白、心肌IL-22mRNA的表达情况。结果抗IL-22抗体组小鼠心肌Nancy株柯萨奇病毒RNA和病毒滴度均明显高于病毒性心肌炎组（P＜0.05）。抗IL-22抗体组IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于对照组（P＜0.05）；抗IL-22抗体组IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均低于病毒性心肌炎组（P＜0.05）；病毒性心肌炎组IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于对照组（P＜0.05）。抗IL-22抗体组血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA含量均高于对照组（P＜0.05）；抗IL-22抗体组血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA含量均低于病毒性心肌炎组（P＜0.05）；病毒性心肌炎组血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA含量均高于对照组（P＜0.05）。结论抗IL-22抗体能够加重病毒性心肌炎小鼠心肌病毒的复制，降低小鼠心肌炎性因子的表达，降低小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA水平。

抗IL-22抗体；IL-17A基因；病毒性心肌炎；小鼠

［Abstract］Objective To inject anti-IL-22 antibody into IL-17A gene knockout viralmice intraperitoneal，and investigate the impactof anti-IL-22 antibody on IL-17A gene knockout viralmice.M ethods 18micewere divided into anti-IL-22 antibody group，viralmyocarditis group and control group，the anti-IL-22 antibody group and viralmyocarditis group were established viralmyocarditismousemodel.The anti-IL-22 antibody group mice were injected anti-IL-22 antibody 50μg by intraperitoneal，viralmyocarditis group mice were injected corresponding volume PBS by intraperitoneal，the control group mice received no treatment.Observed the copy of Nancy strain coxsackie virus，the expression ofmyocardialmyocarditis factor and serum IL-22 protein，myocardial IL-22mRNA expression at 2 weeks aftermodeling in each group mice.Results The nancy coxsackie virus RNA and viral titers of anti-IL-22 antibody group mice myocardium were significantly higher than viralmyocarditis group（P＜0.05）.The IFN-γmRNA content and TNF-αmRNA levels of anti-IL-22 antibody group were higher than control group（P＜0.05）；the IFN-γmRNA content and TNF-α mRNA levels of anti-IL-22 antibody group were lower than viralmyocarditis group（P＜0.05）；the IFN-γmRNA and TNF-αmRNA levels of viralmyocarditis group were higher than control group（P＜0.05）.The serum IL-22 protein and myocardial IL-22mRNA contents of anti-IL-22 antibody group were higher than control group（P＜0.05）；the serum IL-22 protein and myocardial IL-22 mRNA of anti-IL-22 antibody group were lower than viral myocarditis group（P＜0.05）；the serum IL-22 protein and myocardial IL-22 mRNA of viral myocarditis group were higher than control group（P＜0.05）.Conclusion Anti-IL-22 antibody could increase the viralmicemyocardium virus replication and reduce the expression ofmousemyocarditis factor，reducemice serum IL-22 protein and myocardial IL-22mRNA level.

［Key words］Anti-IL-22 antibody；IL-17A gene；Viralmyocarditis；Mice

病毒性心肌炎是心血管科比较常见的疾病之一，是心肌弥漫性或者局灶性的病变，常继发于病毒、细菌、真菌等心肌感染后，间质炎性细胞浸润和心肌的变性坏死是其主要特征［1，2］。柯萨奇病毒B3是病毒性心肌炎主要的病原体之一［3，4］。IL-17是一种重要的炎性介质，参与多种免疫细胞的增殖和趋化，能够激活免疫细胞，产生多种细胞因子，促进炎症的发生［5］，IL-17能够刺激基质金属蛋白酶的表达，导致自身免疫性心肌炎的心肌纤维化［6］。抗IL-22抗体能够调节IL-22和IL-22R的表达，加重病毒性心肌炎小鼠心肌的炎症反应［7］。本研究将IL-17A基因敲除病毒性心肌炎小鼠腹腔内注射抗IL-22抗体，探讨抗IL-22抗体对IL-17A基因敲除小鼠病毒性心肌炎的影响。

1　资料与方法

1.1一般资料

18只IL-17A基因敲除型、6周龄、雄性、SPF级BALB/c小鼠作为研究对象，18只小鼠均由东京大学医科学研究所提供。

1.2主要试剂和仪器

PBS液（美国Sigma公司）、PCR Mix试剂盒（美国Sigma公司）、ELISA试剂盒（美国Sigma公司）、Anti-IL-22 Ab（美国Fermentas公司）等；离心机（德国SLEE公司）、酶标仪（美国Amersham公司）、PCR仪（美国Amersham公司）等。

1.3方法

小鼠分组和处理：将18只小鼠随机平均分为3组，抗IL-22抗体组、病毒性心肌炎组和对照组，每组6只，抗IL-22抗体组和病毒性心肌炎组小鼠腹腔内注射含100TCID50的Nancy株柯萨奇病毒0.1mL建立病毒性心肌炎小鼠模型，建模当天抗IL-22抗体组小鼠腹腔内注射抗IL-22抗体50μg，病毒性心肌炎小鼠腹腔内注射等体积PBS液，对照组小鼠不做任何处理。建模2周后各组小鼠摘除眼球取血后处死，取小鼠心脏备用。

小鼠心肌Nancy株柯萨奇病毒滴度评估：将小鼠心肌组织剪碎，加入PBS液，研磨成匀浆状，加入PBS，冻融3次，离心，吸出上清液，加入PBS液，每管100μL分装到小管中，采用空斑形成法评估抗IL-22抗体组和病毒性心肌炎组小鼠心肌Nancy株柯萨奇病毒滴度。

各组小鼠血清IL-22蛋白含量测定：将小鼠血液离心后去血清，采用ELISA法进行血清IL-22蛋白含量的测定。

各组小鼠心肌IFN-γmRNA、TNF-αmRNA和IL-22mRNA的含量测定：采用RT-PCR法测定小鼠心肌组织中IFN-γmRNA、TNF-αmRNA和IL-22 mRNA含量：常规提取小鼠心肌组织中的总RNA，3μL 总RNA加入到PCR反应管中进行RT-PCR反应，经GenBank获得目的基因和β-肌动蛋白基因序列，由Primer5.0设计引物，有上海生工生物技术有限公司合成引物，PCR反应条件：PCR总体积20μL，95.0℃预变性3min，95.0℃变性15 s，60.0℃退火60 s，共40个循环，每个反应设复孔，实验数据采用上△Ct法处理，计算小鼠心肌IFN-γmRNA、TNF-αmRNA和IL-22 mRNA的相对含量。

Nancy株柯萨奇病毒RNA采用RT-PCR法进行测定。

1.4主要观察指标

观察抗IL-22抗体组和病毒性心肌炎组小鼠心肌Nancy株柯萨奇病毒的复制情况以及抗IL-22抗体组、病毒性心肌炎组和对照组小鼠心肌炎性因子和血清IL-22蛋白、心肌IL-22 mRNA的表达情况。

1.5统计学方法

采用SPSS12.0软件进行分析，多组之间计量资料比较采用方差分析，两组之间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1抗IL-22抗体组和病毒性心肌炎组小鼠心肌Nancy株柯萨奇病毒的复制情况

由表1看出：抗IL-22抗体组小鼠心肌Nancy株柯萨奇病毒RNA和病毒滴度均明显高于病毒性心肌炎组（P＜0.01）。表明抗IL-22抗体加重病毒性心肌炎小鼠心肌病毒的复制。

表1　抗IL-22抗体组和病毒性心肌炎组小鼠心肌CVB3病毒的复制情况（±s）

表1　抗IL-22抗体组和病毒性心肌炎组小鼠心肌CVB3病毒的复制情况（±s）

组别n Nancy株柯萨奇病毒RNA Nancy株柯萨奇病毒滴度（×104pfu/g）抗IL-22抗体组病毒性心肌炎组t值P 66 1.98±0.27 1.06±0.16 15.348 ＜0.001 10.87±1.23 0.94±0.02 67.425 ＜0.001

2.2抗IL-22抗体组、病毒性心肌炎组和对照组小鼠心肌炎性因子比较

由表2看出：抗IL-22抗体组IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于对照组（t值分别为8.263、5.316，P值分别为＜0.001、0.004）；抗IL-22抗体组IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均低于病毒性心肌炎组（t值分别为9.452、7.157，P均＜0.001）；病毒性心肌炎组IFN-γmRNA含量和TNF-α mRNA含量均高于对照组（t值分别为15.241、14.374，P均＜0.001）。表明病毒性心肌炎组的炎性因子蛋白含量最高，抗IL-22抗体能够降低病毒性心肌炎小鼠心肌炎性因子的表达。

表2　三组小鼠心肌炎性因子比较（±s）

表2　三组小鼠心肌炎性因子比较（±s）

组别n IFN-γmRNA含量TNF-αmRNA含量抗IL-22抗体组病毒性心肌炎组对照组F值P 666 1.45±0.21 2.52±0.24 1.01±0.03 12.164 ＜0.001 1.17±0.09 1.62±0.23 1.02±0.05 8.964 ＜0.001

2.3抗IL-22抗体组、病毒性心肌炎组和对照组小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA的表达情况

由表3看出：抗IL-22抗体组血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均高于对照组（t值分别为4.157、4.633，P值分别为0.012、0.008）；抗IL-22抗体组血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均低于病毒性心肌炎组（t值分别为17.241、14.347，P均＜0.001）；病毒性心肌炎组血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均高于对照组（t值分别为24.751、12.374，P值均为＜0.001）。表明病毒性心肌炎组小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA含量最高，抗IL-22抗体能够降低病毒性心肌炎小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA水平。

表3　三组小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA的表达情况（±s）

表3　三组小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA的表达情况（±s）

组别n血清IL-22蛋白（pg/mL）心肌IL-22mRNA 抗IL-22抗体组病毒性心肌炎组对照组F值P 666 11.8±1.7 16.5±1.9 2.1±0.8 13.512 ＜0.001 3.58±0.34 4.19±0.45 1.07±0.09 11.527 ＜0.001

3　讨论

病毒性心肌炎可以很快发展为扩张型心肌病或者慢性心肌炎，甚至发生心力衰竭，是年轻患者发生心源性猝死的常见原因之一［8-10］。柯萨奇病毒是病毒性心肌炎常见的病原体之一［11］，免疫介导的损伤和细胞毒性的直接作用在心肌病理损伤中发挥重要作用，其中T细胞在炎症和免疫反应中扮演主要角色：杀伤性T细胞能够介导细胞裂解；Th1细胞能够介导迟发型超敏反应，出现单核细胞浸润的炎症反应［12，13］。Th17细胞在多种免疫性疾病中出现过度激活和多克隆状态，主要分泌肿瘤坏死因子、白细胞介素-17以及白细胞介素17A等细胞因子，参与教导免疫细胞的局部浸润，Th17细胞及其分泌的IL-17参与多种免疫性疾病的发生发展过程［14，15］。IL-17A的表达异常和多种纤维化性疾病关系也比较密切，参与心肌纤维化等纤维化疾病的发生和发展，IL-17A引起心肌纤维化的过程主要通过刺激基质金属蛋白酶的表达，参与免疫性心肌炎的心肌纤维化［16，17］。

IL-22是IL-10家族成员，由免疫系统细胞产生，IL-22作用于IL-22受体，活化其下游通路，IL-22参与免疫反应、炎症反应以及病毒感染等过程越来越受到重视，IL-22生物学效应比较复杂，既具有致病性作用，也具有保护性作用，在同一疾病的发生过程中，IL-22可能发生相反的短期效应和长期效应［18，19］。IL-22参与IL-17介导的多种疾病，两者共同作用引起抗炎因子的产生，IL-22在炎症反应中发挥抗炎作用还是促炎作用可能有IL-17调节，在不同的组织和细胞微环境下，有无IL-17A的表达，IL-22对组织发挥保护作用还是破坏作用不同［20］。本研究通过将18只小鼠分为抗IL-22抗体组、病毒性心肌炎组和对照组，建立病毒性心肌炎小鼠模型，抗IL-22抗体组小鼠腹腔内注射抗IL-22抗体，病毒性心肌炎小鼠腹腔内注射PBS液，观察各组小鼠心肌柯萨奇病毒的复制情况、心肌炎性因子表达情况和血清IL-22蛋白、心肌IL-22mRNA的表达情况。结果发现：抗IL-22抗体组小鼠心肌Nancy株柯萨奇病毒RNA和病毒滴度均明显高于病毒性心肌炎组。抗IL-22抗体组IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于对照组；抗IL-22抗体组IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均低于病毒性心肌炎组；病毒性心肌炎组IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于对照组。抗IL-22抗体组血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均高于对照组；抗IL-22抗体组血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均低于病毒性心肌炎组；病毒性心肌炎组血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均高于对照组。由此可见，抗IL-22抗体能够加重病毒性心肌炎小鼠心肌病毒的复制，降低小鼠心肌炎性因子的表达，降低小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA水平。在没有IL-17A共表达的情况下，IL-22对心肌炎症发挥保护作用，IL-17A和IL-22相互作用能够调节TNF-α等炎性因子的表达，在没有IL-17A的共同表达情况下，阻断IL-22能够减少病毒性心肌炎小鼠心肌中的TNF-α等水平。Th1能够增加急性炎症的发展，但能够抑制病毒复制和心肌炎的发展，抗IL-22抗体组IFN-γ表达量减少，可能和病毒复制增加、心肌炎症减轻有关。在没有IL-17A的环境中，IL-22也能减少病毒的复制。由此可见，在没有IL-17A表达的情况下，IL-22能够抑制心肌病毒的复制，其机制可能和IL-22促进TNF-α和IFN-γ的表达有关。

［1］Jacoby C，Borg N，Heusch P，et al.Visualization of immune cell infiltration in experimental viralmyocarditis by （19）FMRI in vivo［J］.MAGMA，2014，27（1）：101-106.

［2］Zhang YY，Li JN，Xia HH，et al.Protective effects of losartan in mice with chronic viral myocarditis induced by coxsackievirus B3［J］.Life Sci，2013，92（24-26）：1186-1194.

［3］Sharma A，Marceau C，HamaguchiR，etal.Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitromodel forcoxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform［J］.Circ Res，2014，115 （6）：556-566.

［4］Ye T，Yue Y，Fan X，et al.M cell-targeting strategy facilitatesmucosal immune response and enhances protection against CVB3-induced viral myocarditis elicited by chi tosan-DNA vaccine［J］.Vaccine，2014，32（35）：4457-4465.

［5］Sato F，Omura S，Kawai E，et al.Distinct kinetics of viral replication，T cell infiltration，and fibrosis in three phases of myocarditisfollowing Theiler's virus infection［J］.Cell Immunol，2014，292（1-2）：85-93.

［6］Yu M，Hu J，Zhu MX，etal.Cardiac fibroblasts recruit Th17 cells infiltration into myocardium by secreting CCL20 in CVB3-induced acute viral myocarditis［J］.Cell Physiol Biochem，2013，32（5）：1437-1450.

［7］Kong Q，Xue Y，Wu W，et al.IL-22 exacerbates the severity of CVB3-induced acute viralmyocarditis in IL-17A-deficientmice［J］.MolMed Rep，2013，7（4）：1329-1335.

［8］Sellier-Leclerc AL，Belli E，Guérin V，etal.Fulminant viralmyocarditis after rituximab therapy in pediatric nephrotic syndrome［J］.Pediatr Nephrol，2013，28（9）：1875-1879.

［9］Shauer A，Gotsman I，Keren A，etal.Acute viralmyocarditis：Current concepts in diagnosis and treatment［J］.Isr Med Assoc J，2013，15（3）：180-185.

［10］Reddy J，Massilamany C，Buskiewicz I，et al.Autoimmunity in viralmyocarditis［J］.Curr Opin Rheumatol，2013， 25（4）：502-508.

［11］Wang D，Chen Y，Jiang J，et al.Carvedilol has stronger anti-inflammation and anti-virus effects than metoprolol inmurinemodelwithcoxsackievirus B3-induced viralmyocarditis［J］.Gene，2014，547（2）：195-201.

［12］Wu F，Fan X，Yue Y，et al.A vesicular stomatitis virusbased mucosal vaccine promotes dendritic cell maturation and elicits preferable immune response against coxsackievirus B3 induced viral myocarditis［J］.Vaccine，2014，32（31）：3917-3926.

［13］Ursu ON，Sauter M，Ettischer N，et al.Heme oxygenase-1 mediates oxidative stress and apoptosis in coxsackievirus B3-inducedmyocarditis［J］.Cell Physiol Biochem，2014，33（1）：52-66.

［14］Xie Y，Zhang X，Tian Z，et al.Preexposure to PM2.5 exacerbates acute viral myocarditis associated with Th17 cell［J］.Int JCardiol，2013，168（4）：3837-3845.

［15］Liu YL，Wu W，Xue Y，et al.MicroRNA-21 and-146b are involved in the pathogenesis of murine viral myocarditisby regulating TH-17 differentiation［J］.Arch Virol，2013，158（9）：1953-1963.

［16］Liu Y，Zhu H，Su Z，et al.IL-17 contributes to cardiac fibrosis following experimental autoimmune myocarditis by a PKCβ/Erk1/2/NF-κB-dependentsignaling pathway［J］. Int Immunol，2012，24（10）：605-612.

［17］解玉泉.Th17细胞/白介素-17在病毒性心脏病中的作用及机制研究［D］.复旦大学，2012.

［18］Azizi G，Yazdani R，Hamid KM.IL-22 produced by T helper cell 22 as a new player in the pathogenesis of immune tthrombocytopenia［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2015，15（3）：242-250.

［19］Lai R，Xiang X，Mo R，et al.Protective effect of Th22 cells and intrahepatic IL-22 in drug induced hepatocellular injury［J］.JHepatol，2015，63（1）：148-155.

［20］孔清.Th22细胞及IL-22与小鼠病毒性心肌炎关系的初步研究［D］.广西医科大学，2014.

Influences of antiIL-22 antibody on IL-17A gene knockout viralm ice

DONG Zhibing CHEN Yunpeng
Department of Cardiovascular Medicine，Wenling First People's Hospital in Zhejiang Province，Wenling 317500，China

R542.2

A

1673-9701（2016）15-0019-04

浙江省温岭市第二批科技项目（2011WLCB0087）

2016-02-18）