池玉杰　　　　　　伊洪伟　　　　吉海龙

(东北林业大学，哈尔滨，150040)　　　(重庆市农业科学院果树研究所)　　　(东北林业大学)



长枝木霉菌株T05液态发酵产孢和菌丝生物量条件的筛选1)

池玉杰伊洪伟吉海龙

(东北林业大学，哈尔滨，150040)(重庆市农业科学院果树研究所)(东北林业大学)

采用PDB培养基，对长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)菌株T05液态发酵产分生孢子、菌丝和厚垣孢子的理想条件进行了筛选，分别测试了培养温度、培养液初始pH、供氧量和初始接菌量的影响。结果表明：在150 r·min-1振荡培养条件下，菌株T05产生分生孢子的适宜液态发酵条件为，培养温度30 ℃、培养液初始pH=12、供氧条件为250 mL的三角瓶装瓶量40 mL、250 mL的三角瓶装瓶量100 mL的情况下初始接菌量为0.5 mL，在这样的培养条件下培养5～7 d；产生菌丝和厚垣孢子的适宜液态发酵条件为，培养最适温度较低为20 ℃培养5 d；培养液初始pH值接近中性为6；供氧条件是初始装液量较多较有利，为250 mL的三角瓶装瓶量160 mL；初始接菌量是较少较有利，为250 mL的三角瓶装瓶量100 mL的情况下接菌量为0.05 mL。

长枝木霉；液态发酵；分生孢子；产孢量；菌丝生物量；厚垣孢子

We screened the optimal liquid fermentation conditions forTrichodermalongibrachiatumstrain T05 to produce conidia and hyphae biomass in PDB medium, four factors including culture temperature, initial pH value of culture solution, oxygen supply quantum, and tested initial inoculum volume for sporulation quantity. Under 150 r·min-1oscillatory incubation, the optimal conditions for T05 to produce conidia were the temperature of 30 ℃, the initial pH of 12, 40 mL PDB medium bottled in 250 mL conical flask, and the initial inoculum volume 0.5 mL in 100 mL PDB in 250 mL flask for 5-7 d culture, and the optimal conditions to produce mycelia and chlamydospores were the culture temperature of 20 ℃, the initial pH of 6, 160 mL PDB medium bottled in 250 mL conical flask, and the initial inoculum volume 0.05 mL in 100 mL PDB in 250 mL flask for 5 d.

在现代农业中，化学农药的使用已经大大减少，正在使用中的化学农药也多为低毒、低残留类产品，对环境的保护已经深为大众所接受。然而，虽然采用的农药为低毒、低残留产品，仍然不能达到对环境无污染的要求。因此，生物农药的研究越来越受到重视。木霉(Trichodermaspp.)作为优良的植物生防菌，凭借着对多种真菌病害的广谱抗性、对环境的广泛适应性和多机制性等特点，自20世纪30年代以来一直都是植物病害专家研究的重要对象，其生防效果已得到广泛认同[1-2]，已经在植物病害的防治中发挥了巨大作用。木霉生物制剂的使用不仅可以减少化学杀菌剂的使用，许多木霉还具有降解和转化一些可能有害或持久存在的有害的环境污染物及多种有机大分子的能力，其中包括有害的生物异源物质如DDT、马拉硫磷、茅草枯、内硫肽、五氯硝基苯和五氯苯酚[3-4]。不同的木霉菌株生长需要相对不同的营养和环境条件，如果要广泛应用木霉防治植物病害，首先要解决的问题就是要获得木霉高生物量的不同产物。很多研究表明，木霉的孢子不但具有很好的生防效果，而且能提高出苗率、促进植株生长、增加产量等[5-6]。木霉类制剂主要包括分生孢子制剂、厚垣孢子和菌丝体制剂[7]，木霉一般除产生大量的分生孢子外，菌丝上也会产生较多的厚垣孢子[8]。由于木霉分生孢子产量大，木霉菌生防制剂所采用的剂型主要为分生孢子制剂，目前在欧美等国家已有大量商品化的产品，主要采用绿色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)等菌种生产。

很多的研究者应用廉价的培养基对木霉的发酵条件进行了一系列研究，其中包括液体培养和半固体培养。在实验室获得木霉菌发酵产孢的优化条件对木霉孢子的大量生产具有重要意义，木霉的产孢条件受营养条件、温度、光照、pH值、通氧量、接菌量等多项因素的影响[9-10]，研究这些液态发酵产孢条件以期获得较高量的孢子，是实现木霉菌在生物防治方面广泛应用的前提。目前国内对于长枝木霉(T.longibrachiatum)在林木病害生物防治方面的研究还很少[11]。本研究以经济易得的马铃薯葡萄糖液体培养基为营养基质，从培养温度、pH值、供氧量、接菌量几个方面研究了长枝木霉菌株T05产分生孢子、菌丝和厚垣孢子的条件，通过摇瓶法液态发酵产孢条件的优化研究，以期为今后大批量工业化生产长枝木霉菌剂提供理论数据基础。

1　材料与方法

1.1菌种来源和培养基

长枝木霉菌株(T.longibrachiatum)T05，是自我采集、自行分离得到的1株木霉菌株，保存在东北林业大学森林病虫病理实验室(4 ℃)。

培养基：PDA(去皮马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，琼脂条20 g，加水定容至1 L)；PDB(去皮马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，加水定容至1 L)。

1.2菌种培养与分生孢子的收集

将菌株T05接种到直径9 cm的PDA平板中心，在25 ℃下培养7 d，产孢后用10 mL无菌水将分生孢子洗脱下来(菌丝顶端或中间还有厚垣孢子，但被洗脱下来的主要是分生孢子)，用血球计数器调制成1×107个·mL-1的悬浮液，备用。

1.3T05液态发酵产孢条件的筛选

1.3.1不同温度下的产孢情况和菌丝生物量

在250 mL的三角瓶中加入100 mL PDB培养液，每瓶接种1.2中的孢子悬浮液1 mL，分别在20、23、25、27、30 ℃下于150 r·min-1振荡培养7 d，分别在3、5、7 d镜检分生孢子和厚垣孢子的产生情况，并称量菌丝干质量。

1.3.2不同初始pH值下的产孢情况和菌丝生物量

在250 mL的三角瓶中分别加入100 mL PDB培养液，用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH溶液调节其pH值分别为2、4、6、8、10、12、14，每瓶接种1.2中的孢子悬浮液1 mL，分别于24、29 ℃下150 r·min-1振荡培养7 d，7 d镜检与称质量同1.3.1。

1.3.3不同供氧条件下(装液量不同)的产孢情况和菌丝生物量

在250 mL三角瓶中分别加入20、40、80、160 mL的PDB培养液，每瓶接种1.2中的孢子悬浮液1 mL，分别于24、29 ℃下150 r·min-1振荡培养7 d，3、5、7 d镜检与称质量同1.3.1。

1.3.4不同初始接菌量下的产孢情况和菌丝生物量

在250 mL三角瓶中加入100 mL的PDB培养液，每瓶分别接种1.2中的孢子悬浮液0.05、0.50、1.00、1.50 mL，分别于25、30 ℃下150 r·min-1振荡培养7 d，3、5、7 d镜检与称质量同1.3.1。

1.3.1～1.3.4中的每个处理都为3个重复。

2　结果与分析

2.1温度对产孢情况和菌丝生物量的影响

在不同温度条件下3、5、7 d内，菌株T05分生孢子的产生情况和菌丝生物量见表1。由表1可知，在试验范围内，分生孢子的产量总体上随着温度的升高而递增，在30 ℃下培养5 d时达到最高，为22.5×105菌落·mL-1，其次是在30 ℃下培养3 d时，此时的分生孢子量也已经为9.5×105菌落·mL-1。因此，确定30 ℃为菌株T05液体发酵产生分生孢子的最适温度，在此温度下最适培养时间为5 d。在观察中也发现，除了在20、23 ℃下3 d时，厚垣孢子的量较少外，其他各处理也产生较大量的厚垣孢子，随着培养时间的加长，厚垣孢子的产量也增加，5～7 d最多。厚垣孢子生长在菌丝顶端和中间，是不连续或连续的单个和多个厚壁、内部原生质稠密的细胞，一般情况下菌丝量大，厚垣孢子的数量也多。培养温度为20 ℃、5 d时菌丝干质量最大，为1.003 4 g，并且各个培养温度下均在5 d时菌丝干质量达到最大。随着温度的升高，菌丝生物量呈缓慢下降的趋势。所以，对于以生产菌丝和厚垣孢子为目的的发酵生产中，可以选择培养温度20 ℃、培养5 d为最适。

表1温度和培养时间对T05菌株分生孢子数量和菌丝干质量的影响

温度/℃培养时间/d分生孢子/105菌落·mL-1菌丝干质量/g2031.250.899154.501.003474.500.85762332.250.705054.000.738770.500.78342532.500.687253.750.711677.250.710027300.575655.750.730474.750.59473039.500.7093522.500.584573.250.5290

2.2初始pH对产孢情况和菌丝生物量的影响

在不同初始pH条件下分别在24、29 ℃下培养7 d时，菌株T05在第7天分生孢子的产生情况和菌丝生物量见表2。由表2可知，在不同初始pH条件下，在培养温度分别为24 ℃和29 ℃时，有较一致的分生孢子产生曲线，在较酸的条件下(pH<8)都不利于T05产生分生孢子，观察中发现在初始pH=2时均不产生分生孢子，此时仅产生少量的厚垣孢子；以后随着pH值的上升，分生孢子和厚垣孢子的量都上升，分生孢子的数量都是在初始pH=12时达到最大，在24 ℃下为129.0×105菌落·mL-1，在29 ℃下为553.0×105菌落·mL-1；当pH值继续增加到14时，分生孢子分别下降到73.0×105、516.0×105菌落·mL-1，但是均高于pH=10时的分生孢子量。因此，对于以获得分生孢子为目的的发酵生产中，确定菌株T05无论温度是在24 ℃还是在29 ℃下，产生分生孢子的最适pH值都为12。但是，在29 ℃下的分生孢子量远大于在24 ℃下，这与2.1的温度测试结果相似。通过将2.2与2.1的结果对比可以看出，在适宜高温29～30 ℃下提高初始pH值到12，可以20多倍地提高分生孢子的产量。

培养温度分别为24、29 ℃时，也有较一致的菌丝生物量曲线，均在pH=6时菌丝干质量达最大，分别为0.649 4、0.679 8 g；均在pH=2时菌丝干质量有最小值，分别为0.112 2、0.220 6 g。在观察中也发现，在pH值4～14时，在2个温度下菌株T05也都能产生大量的厚垣孢子。因此，对于以获得菌丝和厚垣孢子为目的的发酵生产中，初始pH=6为最适。

表2初始pH值对T05菌株分生孢子数量和菌丝干质量的影响

温度/℃初始pH值分生孢子/105菌落·mL-1菌丝干质量/g2420 0.112242.00.523863.00.649484.00.58521029.00.461912129.00.46231473.00.388429200.220644.00.521965.00.67988153.00.461410373.00.350812553.00.278014516.00.2585

2.3供氧条件对产孢情况和菌丝生物量的影响

在不同供养条件下(不同装瓶量)培养温度分别为24、29 ℃时，菌株T05在第3、5、7天分生孢子的产生情况和菌丝生物量见表3。由表3可知，在24 ℃下250 mL三角瓶装液量80 mL、培养时间为5 d时，分生孢子产量最大，为25.0×105菌落·mL-1；在29 ℃下250 mL三角瓶装液量40 mL、培养时间为5 d时，分生孢子产量最大，为211.0×105菌落·mL-1，其次是在同样条件下3 d时，分生孢子量为156.0×105菌落·mL-1。可见，在29 ℃下的分生孢子量远大于在24 ℃下，由此确定菌株T05产生分生孢子的最适供氧条件是在29 ℃下250 mL三角瓶装液量40 mL、培养时间为5 d。

培养温度分别为24、29 ℃时，有较一致的菌丝生物量规律，都是随着装瓶量的增加，菌丝干质量也逐渐增加，都是在装瓶量为160 mL、培养时间为7 d时，菌丝干质量达到最大，分别为0.970 6、0.769 8 g，培养温度为24 ℃下的菌丝生物量高于在29 ℃时的，可见温度低有利于菌丝生物量的积累，这与2.1的温度测试结果相似。在观察中也发现，在24 ℃下不同装液量的各个处理在3、5、7 d时都能产生大量的厚垣孢子；在29 ℃下20 mL装液量在3、5、7 d时都产生少量的厚垣孢子，40～80 mL装液量在3、5、7 d时就产生逐渐增多到大量的厚垣孢子，160 mL装液量在3、5、7 d时都只产生厚垣孢子，而不产生分生孢子。因此，对于以获得菌丝和厚垣孢子为目的的发酵生产中，初始装液量较多较有利。

表3　供氧条件对T05菌株分生孢子数量和菌丝干质量

2.4接菌量对产孢情况和菌丝生物量的影响

在不同接菌量条件下培养温度分别为25、30 ℃时，菌株T05在第3、5、7天分生孢子的产生情况和菌丝生物量见表4。由表4可知，在25 ℃下初始接菌量为1.5 mL，培养时间为7 d时，分生孢子数量达最大，为9.0×105菌落·mL-1；而且不同初始接菌量均是7 d达最大值。在30 ℃下初始接菌量为0.5 mL、培养7 d时，分生孢子数量达最大，为35.25×105菌落·mL-1；其次是在接菌量1.0 mL、培养5 d时，分生孢子量达到22.5×105菌落·mL-1。由此确定菌株T05产分生孢子最适的接菌量为30 ℃下250 mL三角瓶中接菌0.5 mL。

不同的初始接菌量之间，菌丝干质量相差不大。在2个温度下都是初始接菌量为0.05 mL，培养时间为5 d时，菌丝干质量达最大，在25 ℃下为0.804 1 g，在30 ℃下为0.911 0 g。因此，对于已获得菌丝为目的的发酵生产中，初始接菌量较少较有利。

表4接菌量对T05菌株分生孢子数量和菌丝干质量的影响

接菌量/mL培养时间/d分生孢子/105菌落·mL-125℃30℃菌丝干质量/g25℃30℃0.0531.250 0.54830.831650.751.000.80410.911074.256.000.62990.71110.5031.0000.61770.798150.506.250.70860.792973.5035.250.78610.85231.0032.509.500.55150.787253.7522.500.64960.819877.253.250.79340.69521.5030.501.000.68090.736751.502.250.62760.771579.001.500.73120.6892

3　结论与讨论

由于木霉菌剂多为孢子制剂，实现木霉孢子的大量生产是使木霉菌能够在防治植物病害上大面积应用的前提。以往研究显示，温度是影响木霉生长的重要因子。本试验测试不同温度、不同时间条件下长枝木霉菌株T05产孢情况发现，在不同温度下菌株T05的孢子在试验范围内随温度的升高产量呈递增的趋势，孢子最大产量和次产量分别在温度为30 ℃的第5天和第3天，这与台莲梅[11]的研究结果一致。以往报道显示，康氏木酶在一定的pH范围内才能产生孢子，过酸或者过碱的环境都不利于孢子的产生。本试验中长枝木霉菌株T05在pH值为2～8的条件下分生孢子产量相对很少，继续升高pH值，分生孢子产生量迅速增大，当pH为12时，分生孢子产生量达到最大，是所有单项测试中的最大值，继续升高pH值到14时，分生孢子的产生量出现下降，这与长枝木霉菌株T115D[11]在pH为7、8时产孢量较大不同，分析原因可能是不同菌株在特定环境条件下形成了独特的产孢条件。从数据结果上看，pH值构成菌株T05分生孢子产量的重要因素。供氧条件对木霉产生孢子有很大的影响，不同的装液量提供了不同的供氧状态。本试验中，在24 ℃下培养5 d时，250 mL三角瓶装液量80 mL产孢量最大，而在29 ℃下培养5 d时，250 mL三角瓶装液量40 mL产孢量最大。但在29 ℃下的分生孢子量远大于在24 ℃下。可见，温度升高，菌株T05产孢速度快，耗氧量增加。综合在不同温度和不同装液量条件下的培养结果可知，在分生孢子的产生上温度高低要求不同的装瓶量，温度越高，会迅速产生更多的分生孢子，供氧量需求也急速增加。在5 d相同的培养时间内，少量的培养液中却能产生更多量的分生孢子，既经济划算又增加了产孢量。相同的培养环境条件，只有适当的接菌量才能达到既不浪费营养，也不至于造成菌种的浪费。本研究试验范围内，菌株T05产分生孢子最适的接菌量为30 ℃下250 mL三角瓶中装瓶量100 mL的情况下初始接菌量为0.5 mL。以上从培养温度、初始pH值、供氧条件和初始接菌量等4个方面的筛选结果来看，长枝木霉菌株T05产生分生孢子的适宜液态发酵条件为：在150 r·min-1振荡培养条件下，培养温度30 ℃、培养液初始pH=12、供氧条件为250 mL的三角瓶装瓶量40 mL、在250 mL的三角瓶装瓶量100 mL的情况下初始接菌量为0.5 mL，在这样的培养条件下培养5～7 d。

本研究也从培养温度、初始pH值、供氧条件和初始接菌量4个方面进行了获得高菌丝生物量和厚垣孢子的条件筛选，在150 r·min-1振荡培养条件下，产生菌丝和厚垣孢子的适宜液态发酵条件为：培养最适温度较低为20 ℃培养5 d；培养液初始pH值接近中性为6；供氧条件是初始装液量较多较有利，为250 mL的三角瓶装瓶量160 mL；初始接菌量是较少较有利，为250 mL的三角瓶装瓶量100 mL的情况下接菌量为0.05 mL。

本试验虽然只是实验室内的小规模试验，但对大规模发酵生产具有一定的指导意义。

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1)国家林业局科技成果推广项目([2004]57号);黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD200901)。

Optimal Conditions forTrichodermalongibrachiatumStain T05 for Producing Conidia and Chlamydospores//

Chi Yujie

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Yi Hongwei(Fruit Tree Institute of Chongqing Agriculture Academy); Ji Hailong(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(1)：110-113.

Trichodermalongibrachiatum; Liquid fermentation; Conidia; Sporulation quantity; Hyphae biomass; Chlamydospore

池玉杰，女，1964年4月生，东北林业大学林学院，教授。E-mail:chiyujienefu@126.com。

2015年7月16日。

S718.81

责任编辑：程红。