王青贵阳护理职业学院，贵州贵阳550008

正常生理和1型糖尿病病理下的慢性生长激素刺激对肝脏胰岛素信号的影响分析

王青
贵阳护理职业学院，贵州贵阳550008

目的探讨慢性生长激素在1型糖尿病病理与正常生理下对肝脏胰岛素信号的影响。方法对健康小鼠注射慢性生长激素，对1型糖尿病小鼠以链脲佐菌素诱导，并进行Akt和PTEN的检测。结果对健康小鼠注射慢性生长激素后肝内胰岛素信号通路分子Akt磷酸化能够被抑制，同时会显著增加该信号通途的负调控分子PTEN表达（P＜0.05）；与此同时慢性生长激素刺激T1DM C57BL/6小鼠肝内Akt磷酸化也能被抑制（P＜0.05），但是在PTEN表达水平上的改变不显著（P＞0.05）；除此之外对胰岛素信号的p85调节亚基进行检测，在慢性生长激素刺激下两种小鼠的表达水平无变化（P＞0.05）。结论将慢性生长激素长期使用可以对肝脏胰岛素信号进行抑制，机制主要与PTEN表达升高有关，然而机制在病理状态下不同。

正常生理；1型糖尿病；慢性生长激素；肝脏胰岛素信号

生长激素是一种肽类激素，由腺垂体嗜酸性细胞分泌，主要受昼夜节律、性别、年龄、生长激素释放激素的调节和影响，它的功能主要为代谢调节和促进生长发育，作用的脏器主要包括了肾脏、肺、肝脏、肌肉和心脏等，而对肝脏的影响作用尤为显著。目前慢性生长激素的应用具有广泛性，但是在长期使用的情况下就会将各种副作用引发，如胰岛素抵抗或者是肿瘤等，目前对于相关机制还在进一步研究中，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选择30只Balb/c小鼠和50只C57BL/6小鼠，所有小鼠均为雄性，且周龄在6～8周，均符合SPF级饲养标准。

1.2方法

1.2.1给药与分组以30只Balb/c小鼠为调查对象，将其随机分为两组，每组15只，一组注射无菌生理盐水（对照组1组），另一组注射慢性生长激素（观察组），且两组注射的体积相等，均是经腹腔注入，注入时间为下午3：00～5：00，持续性注射3周。

1.2.2构建T1DM小鼠模型随机将50只C57BL/6小鼠分为STZ组和对照2组，各组分别为30只和20只，对照2组注射120 g/kg的柠檬酸钠，而STZ组则注入STZ，同样是经腹腔，且注射3 d，之后进行小鼠体质量和空腹血糖的测定，当空腹血糖在11.1 mmol/L及以上的情况下则视为T1DM造模成功。之后再对造模成功的T1DM小鼠进行分组，即糖尿病GH组和模型组，每组15只，前者每天下午3：00～5：00注射1μg/g rhGH，而后者则将无菌生理盐水注射，且体积相等，持续性注射3周。

1.2.3采集与处理标本在采用慢性生长激素刺激3周后，于前1 d晚上11点对小鼠禁食，但可以饮水，并于当天凌晨5：30将其处死，首先对小鼠空腹体质量进行测定，并于处死前10 min将2 IU/kg生理盐水或等量重组人胰岛素经腹腔注射，同时将戊巴比妥钠于处死前注射，在完全麻醉的情况下对小鼠进行取肝和处死。

1.2.4Wes t er n b l ot t ing蛋白印迹分析对各组小鼠的肝脏组织进行提取，约为绿豆大小，之后进行研磨，将蛋白提取做Western blotting检测p85、PTEN表达水平与Akt磷酸化水平。将肝组织蛋白提取，以8%聚丙烯酞胺SDS-PAGE恒压电泳，100 mA恒定电流进行150 m in转膜；之后在进行半小时的5%脱脂奶室温封闭，在杂交袋中置入PVDF膜，并在4℃的环境中孵育4～6 h或者是温室条件下孵育一抗1～2 h，将二抗以1∶3 000～1∶5 000的比例进行稀释，室温下孵育二抗与PVDF膜30 min；清洗15 min PBS-T，持续3～6次，直至显影、发光。扫描胶片，对各组目标条带的灰度值以目的条带的分子量为依据进行Image J软件分析，内参为GAPDH或β-actin，参照为总Akt，对目的蛋白的相对表达量以相应蛋白条带与Akt、GAPDH、β-actin的比值进行计算。

1.3统计方法

对调查的数据资料借助统计学软件SPSS 16.0进行处理分析，以标准差（）表示数据，以t检验两组间比较，当P＜0.05的情况下则说明差异具有统计学意义。

2　结果

2.1T1DM小鼠与健康小鼠在注射慢性生长激素后体质量的变化

在对观察组和对照1组小鼠采用慢性生长激素刺激3周后，两组小鼠的体质量均增加明显，但是相比较之下，观察组小鼠的体质量增长更优于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与此同时糖尿病GH组和模型组小鼠采用慢性生长激素刺激3周后，两组小鼠的体质量均下降明显，然而相比之下，在体质量减轻幅度上模型组大于糖尿病GH组，差异有统计学意义（P＜0.05），具体如下表所示。

表1　观察组和对照1组体质量增加比较（）

表1　观察组和对照1组体质量增加比较（）

P分组体质量增加幅度对照1组观察组t检验t 3.854±0.662 6.822±1.302 -4.236 0.001

表2　糖尿病GH组和模型组体质量降低比较（）

表2　糖尿病GH组和模型组体质量降低比较（）

分组体质量增加幅度糖尿病GH组模型组t检验t P 1.632±1.101 3.821±1.832 3.265 0.005

2.2调节亚基p85表达水平变化

对照1组与观察组在经慢性生长激素刺激之后，观察组的p85表达水平改变不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）；同时模型组与观察组相比，在慢性生长激素刺激之后T1DM小鼠的p85表达水平改变同样不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3胰岛素信号p-Akt

对标志蛋白Akt的活性水平进行检测得出健康小鼠比对照1组在采用慢性生长激素刺激之后Akt磷酸化水平下降显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）；并且模型组于观察组小鼠在采用慢性生长激素刺激之后Akt磷酸化水平同样下降显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.4负调控分子PTEN的作用

观察组与对照1组在采用慢性生长激素刺激之后，前者的PTEN表达水平增加明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）；但是采用慢性生长激素刺激T1DM小鼠之后，与模型组相比在PTEN表达水平上的改变不显著（P＞0.05）。

3　结论

经以上的调查显示，将慢性生长激素长期使用1型糖尿病小鼠和健康小鼠均会产生胰岛素抵抗。在细胞水平上，无论内源胰岛素刺激是否存在，胰岛素模拟内源性胰岛素分泌30 m in，胰岛素信号均能够被生长激素抑制，由此可见，内源性胰岛素与生长激素诱导胰岛素抵抗无关，并且在机制上有所差异。在机体的衰老、代谢和发育中生长激素具有重要的作用，相关报道指出，高血糖和胰岛素抵抗会出现于荷载分泌GH肿瘤和GH转基因的大鼠中，同时高胰岛素血症会发生于肢端肥大症的病人。与此同时也有相关研究发现，正常儿童与接受长期慢性生长激素的患儿相比，发生2型糖尿病的几率要明显低处许多，约为1/6。在以上的调查研究中，我们对健康小鼠进行长达三周的慢性生长激素刺激，其结果显示小鼠的体质量得到了显著提升，与此同时，小鼠在长期慢性生长激素刺激作用下有高胰岛素血症发生，并且分析结果显示，抑制了小鼠肝内AKt的磷酸化，由此可见，小鼠肝内胰岛素抵抗会因长期使用慢性生长激素产生。生长激素和胰岛素在机体均具有代谢和生长的双重调节作用，细胞表面的胰岛素受体与胰岛素结合，激活受体磷酸化，经Grb2/SOS激活MAPK/ERK通路或者是经胰岛素激活PI3K/Akt通路两条信号路径将调节细胞凋亡、增值和代谢的作用发挥。同时也有相关调查指出，PI3K/Akt通路能够被胰岛素和生长激素共享，这可能是PI3K/Akt是胰岛素作用发挥和生长激素促进生长的交汇点。小鼠在STZ诱导下生成T1DM后会降低体质量，原因可能为STZ诱导损伤的情况下小鼠不适应造成，即便如此，采用慢性生长激素刺激后依旧能够正向调节体质量，同时这也是对照组与T1DM小鼠在慢性生长激素刺激后后者体质量波动幅度小的原因。研究指出，Insulin/PI3K/Akt的激活被PTEN抑制后，胰岛素β细胞的体积可以增加，可见该活性信号通路的调节可能有PTEN参与，但是尚不明确具体机制。以慢性生长激素刺激T1DM小鼠和，PTEN的调节机制尚未明显表现，由此可见，PI3K/Akt信号通路的调节具有多态性。在糖尿病生成动物模型中STZ被广泛地应用，以诱导胰岛素β细胞死亡减少小鼠体内胰岛素分泌，使得糖尿病、高血糖发生。以慢性生长激素刺激健康小鼠之后，p85没有变化，但是PTEN的表达显著升高，由此可见，只要一个表现出抑制，就能够抑制整个信号通路。

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［3］李涛，傅继华，王天莹.糖皮质激素诱导胰岛素抵抗的研究进展［J］.海峡药学，2015（5）：1-5.

R587.1

A

1672-4062（2016）07（a）-0123-02

10.16658/j.cnki.1672-4062.2016.13.123

王青（1982.5-），女，贵州毕节人，本科，讲师，研究方向:医学基础。

2016-04-11）