吕若芸,　王　辉,　陈　忱,　张世雄,　张晓楠,　曹晨华,　魏敬双

华北制药集团新药研究开发有限责任公司, 抗体药物研制国家重点实验室, 石家庄 050015



N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响

吕若芸§,王辉§,陈忱,张世雄,张晓楠,曹晨华,魏敬双*

华北制药集团新药研究开发有限责任公司, 抗体药物研制国家重点实验室, 石家庄 050015

重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗，主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链，通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度，利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性，分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示，N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。

重组抗狂犬病毒单克隆抗体；N-糖链切除；毛细管电泳；中和活性

重组单克隆抗体是通过蛋白质突变和修饰而形成的复杂混合异构物，其结构和功能复杂。在对抗体糖基化的研究中人们发现， N糖基化是其最常见、复杂的蛋白质翻译后修饰之一。通常IgG的每个重链Fc区靠近铰链处的CH2结构域均有一个N-连接的糖基化位点(Asn297)，该位点十分保守[1,2]，其可通过单价链接形成双角N-糖链。在CH2区N-糖链协助维持一种开放的马蹄形构象，有利于促进与Fcγ受体的互作[3]。研究表明糖链在维持重组单克隆抗体的正常结构、功能以及其生物学特性(识别抗原触发免疫系统细胞、调节信号活性等)和物理化学性质(溶解度、蛋白质折叠等)中发挥着重要作用，不同糖型对其功能和活性的影响不完全相同[4～6]；抗体的N-糖基化与Fc区功能相关，可影响抗体Fc部分的结构特点、免疫原性(尤其是1,3-α-Gal糖类)、药代动力学、分布、溶解度以及抗体稳定性，从而可潜在调节抗体的效应功能和药物动力学，删除糖链可导致抗体构象改变，降低或消除与Fcγ受体的结合[1,2]。此外还有研究表明改造抗体 Fc 段的糖链，其某些生物学功能可发生显著改变[7,8]，目前已有通过糖基化改造的治疗性抗体药物进入临床试验阶段[9]。因此，控制重组单克隆抗体的N-糖基化从而优化其效应功能代表一种重要的研究领域。在自体免疫疾病、病毒感染、慢性炎症和癌症中应注重对IgG N-糖基化作用机制的研究，并阐明其分子病理学机制。

本研究中的2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体均为全人源的IgG1亚型抗感染病毒的单抗，由CHO细胞表达，主要用于狂犬病毒暴露后预防。重组抗狂犬病毒单克隆抗体具有典型的IgG1亚型N-糖链结构，即在CH2 结构域有双触角复杂型的岩藻糖化的N-糖链[10,11]，N-糖链包埋在其中，形成特殊的作用形式[12]。本研究使用糖苷酶水解切除重组单克隆抗体的N-糖链，通过糖蛋白染色和毛细管电泳(CE-SDS)检测两种方法确定N-糖链酶解程度，利用快速荧光灶抑制试验法(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)检测其中和活性，研究N-糖链对2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响，以期为其N-糖链的质量控制和抗狂犬病毒抗体的研发提供参考。

1　材料与方法

1.1供试品

由CHO细胞表达的重组抗狂犬病毒单抗Mab1、重组抗狂犬病毒单抗Mab2样品为本实验室制备，蛋白质含量均为5 mg/mL。

1.2试剂及仪器

试剂：超纯水(Milli-Q)、碳酸氢铵(分析纯)、高碘酸(分析纯)、乙酸(分析纯)、乙醇(分析纯)、希夫试剂(分析纯)、偏重亚硫酸钠(分析纯)、盐酸(分析纯)、糖苷酶N-Glycanase (Prozyme,GKE-5006B)、电泳缓冲液(ABsciex公司)、β-巯基乙醇、1640RPMI培养基(Hyclone)、胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)、狂犬病毒标准攻击毒株CVS(武汉生物制品研究所)、抗狂犬病毒N蛋白荧光抗体(Fujirebio.Dia.Inc)、WHO抗狂犬病毒抗体活性标准品、BSR细胞(武汉生物制品研究所)。

仪器：毛细管电泳仪PA800 Plus(ABsciex公司);紫外检测器(ABsciex公司);毛细管:无涂层毛细管(Beckman,338451)，内径50 μm,安装至毛细管卡盒中使其总长31 cm，有效长度为20 cm(进口到检测窗之间的长度)，检测窗为8(100 μm×800 μm);荧光显微镜。

1.3试验方法

1.3.1糖链切除糖苷酶的水解样品制备将2种单抗样品Mab1、Mab2分别用除菌纯水稀释至1 mg/mL，分别取150 μL样品向其中加入6 μL糖苷酶，37℃水浴3 h，4℃放置备用。同时再分别取150 μL浓度为1 mg/mL的单抗样品，不加糖苷酶37℃水浴3 h，4℃放置备用作为对照。

1.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳凝胶采用4.5%浓缩胶，12.5%分离胶。未经任何处理的Mab1、Mab2原液样品和经水浴酶解的样品以及经水浴未酶解的样品与4×还原样品缓冲液混合均匀，70℃水浴3 min后10 000 r/min离心1 min。上样量为10 μg，恒流电泳，浓缩胶电流为10 mA，待指示剂进入分离胶后调整电流至20 mA，指示剂距凝胶底部0.5 cm时停止电泳。

1.3.3糖蛋白染色电泳结束后将电泳胶放入50%乙醇中固定2 h；再放入1%高碘酸，3%乙酸溶液摇洗15 min氧化；3%乙酸-水溶液摇洗2次，每次10 min；希夫试剂避光摇洗45 min染色；0.1%偏重亚硫酸钠，10 mmol/L盐酸摇洗30 min显色。

1.3.4考马斯亮蓝染液复染将经糖蛋白染色后的电泳凝胶放入考马斯亮蓝染色液室温振荡染色1～2 h，染色完成后用蒸馏水漂洗凝胶去除残留的染色液，再加入脱色液脱色至凝胶背景透明后用扫描仪扫描记录，凝胶用保存液保存。

1.3.5毛细管电泳(CE-SDS)将抗体原液样品、糖苷酶水解抗体样品、水浴处理抗体对照样品50 μL与50 μL CE-SDS样品缓冲液混匀，向其中加入5 μL β-巯基乙醇，70℃水浴15 min，室温水浴5 min，10 000 r/min离心1 min。转移75 μL样品至毛细管电泳仪样品管中，进行还原CE-SDS分析。电泳条件:毛细管温度为18℃，在-10 kV电压条件下进样30 s，然后在-15 kV电压下以分离胶为电泳缓冲液分离40 min，检测波长214 nm。

1.3.6中和活性检测采用快速荧光灶抑制试验法(RFFIT)检测抗体原液样品、经糖苷酶水解的抗体样品和水浴处理的抗体对照样品的抗狂犬病病毒的中和活性。将待检样品和标准品3倍系列稀释后与狂犬病病毒标准攻击毒株 CVS 混合，同时设正常对照孔和中和用病毒对照孔，混匀后置37℃中和1 h；再加入BSR细胞悬液，5%CO2、37℃条件下培养24 h；待培养结束吸干培养液，加入PBS清洗并吸干后，再加入预冷至4℃的80%丙酮固定细胞30 min，弃丙酮；最后待挥发干燥后加入抗狂犬病病毒N蛋白荧光标记抗体标记荧光灶，37℃孵育30 min，弃去液体，并用PBS洗板、甩干，每孔加入80%甘油50 μL，在荧光显微镜下观察，比较待检样品和标准品的ED50并按以下公式计算待测样品的效价。

式中E为低于50%荧光灶比例的标准品/供试品稀释度；F为供试品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比；G为供试品高于 50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比；n2为供试品稀释倍数。

供试品效价(IU/mL)=10(J-K)×L

式中J为标准品lgED50；K为供试品lgED50；L为标准品的效价(IU/mL )。

2　结果与分析

2.1重组抗狂犬病毒单克隆抗体的糖染、复染结果

为检测糖苷酶切除糖链条件是否可切除2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体的糖链，对抗体原液样品、糖苷酶水解抗体样品和水浴处理抗体对照样品进行SDS-PAGE，并进行糖染色和考马斯亮蓝复染。结果(图1,彩图见图版二)显示：①在糖染色中2种抗体的抗体原液样品和水浴处理抗体对照样品在重链位置均可见明显条带，轻链位置均无明显条带，表明这2种抗体的糖链可能主要位于重链，轻链上无糖链。而经糖苷酶水解的抗体样品未见明显条带，表明经酶解的样品不再含N-糖链；②经考马斯亮蓝复染后所有的样品均可见明显条带，但2种抗体经糖苷酶水解抗体样品的重链位置与其他2个样品相比重链位置略偏下，这可能是因为切除糖链后重链分子量下降所致。

图1　Mab1和Mab2糖蛋白染色(A)和考马斯亮蓝染液复染(B)Fig.1　Gel staining of Mab1 and Mab2 by periodic acid-schiff method (A) and re-staining by coomassie brilliant blue(B).1：Mab1抗体样品; 2：37℃水浴处理Mab1抗体对照样品; 3：经37℃糖苷酶水解的Mab1抗体样品; 4：Mab2抗体样品; 5：37℃水浴处理Mab2抗体对照样品; 6：经37℃糖苷酶水解的Mab2抗体样品(彩图见图版二)

2.2重组抗狂犬病毒单克隆抗体还原CE-SDS结果

还原CE-SDS电泳可以实现将非糖基化重链与糖基化重链完全分离。为验证糖苷酶切除重组抗狂犬病毒单克隆抗体糖链的效果，对抗体原液样品、糖苷酶水解抗体样品和水浴处理抗体对照样品进行CE-SDS还原电泳。图2、3(彩图见图版二)结果显示：①Mab1抗体和Mab2抗体原液样品和水浴处理抗体对照样品重链(含量均为66.0%)出峰时间重合, 在两者重链前有少量的非糖基化重链成分(分别为0.4%和1.3%,n≥3); ②糖苷酶水解抗体样品可以观察到切除糖链的重链出峰时间提前至非糖基化重链成分处，其含量也显著提高(Mab1抗体和Mab2抗体分别为65.4%和65.8%,n≥3)，糖基化重链含量大大降低(Mab1抗体和Mab2抗体分别为0.7%和1.2%,n≥3)，表明本研究所采用的酶切方法可去除Mab1抗体和Mab2抗体中98%的糖链结构，糖链的切除比较完全。

2.3重组抗狂犬病毒单克隆抗体RFFIT活性测定结果

对2种抗体RFFIT活性测定结果(图4)，结果采用SPSS软件One-way ANOVA数据分析方法分析抗体原液样品、糖苷酶水解抗体样品和水浴处理抗体对照样品效价对数值均值，分析结果表明2种抗体均无显著差异(Mab1 sig=0.73, Mab2sig=0.13,n≥3)。本实验结果表明将糖链切除后2种单抗样品的RFFIT活性未发生明显变化。

图2　Mab1还原CE-SDS图谱Fig.2　The graph of reduced CE-SDS of Mab1.1.为Mab1抗体样品还原CE-SDS图谱;2.为经37℃糖苷酶水解的Mab1抗体样品还原CE-SDS图谱;3.为37℃水浴处理Mab1抗体对照样品还原CE-SDS图谱。(彩图见图版二)

图3　Mab2还原CE-SDS图谱Fig.3　The graph of reduced CE-SDS of Mab2.1.为Mab2抗体样品还原CE-SDS图谱;2.为经37℃糖苷酶水解的Mab2抗体样品还原CE-SDS图谱;3.为37℃水浴处理Mab2抗体对照样品还原CE-SDS图谱。(彩图见图版二)

3　讨论

在SDS-PAGE糖蛋白染色图谱中，可见在所选用的糖苷酶切除糖链的条件下基本无肉眼可见的糖蛋白条带，表明绝大部分糖链已被切除。但糖蛋白染色法的灵敏度较低不能保证所有糖链均被切除，为避免其影响后续试验对结果的判断，采用毛细管电泳法对糖链切除的结果进行了验证，结果表明糖链已切除完全。目前抗体N-糖链分析的常用方法有毛细管电泳(CELIF)、质谱(MALDI-TOF-MS)、亲水相互作用色谱(HILIC-HPLC/UPLC)以及核磁共振法(NMR) 等，这些方法均具有良好的分离度、准确性和精密性，并各有优势。由于不同抗体N-糖链分析方法的样品处理过程和分离机理存在一些差异，使其在部分糖型的检测中存在差异[13]。毛细管电泳具有高效、快速、分离度高、灵敏度高、分离模式多样性以及操作相对简便等特点，能够在几十分钟内完成对单抗N-糖链的检测。因此在抗体N-糖链分析的检验中，CELIF基于产品明确的表征信息，可用于单抗N-糖链进行合理控制[13]。

图4　RFFIT活性测定结果Fig.4　The bioactivity results by RFFIT.注：E为样品效价测定值(IU/mL)；lgE为效价的对数值；Mean lgE为效价对数值的平均值。

本研究中的重组单抗Mab1和Mab2是针对狂犬病毒开发的全人源抗狂犬病毒单抗。Mab1和Mab2切除N-糖链后抗体的中和活性未发生明显下降。其原因可能是：在抗体的空间结构上，抗狂犬病毒抗体的中和作用机制主要是通过抗体的Fab可变区与狂犬病毒表面的G蛋白进行识别[14～16]，负责与抗原特异性结合;而其N-糖链位于CH2区，抗体N-糖链的修饰似乎可诱导CH2区发生结构性改变，同时两者在空间上有一定距离，从而导致这种改变并未延伸到抗原结合的Fab区，因此抗体N-糖链的切除不能明显影响其与抗原的结合能力[17]。因此Mab1和Mab2两种抗体的中和活性在切除糖链后无明显变化，至于切除N-糖链对上述两种抗体的结构稳定性、体内活性、半衰期等方面是否有影响，则有待于我们进一步的研究。

此外,目前已有国内外学者使用大肠杆菌、酵母等表达系统也获得了一些抗狂犬病毒抗体或者片断，如二硫键稳定性Fv 抗体片段(disulfide-stabilized Fv fragment, dsFv)、单链Fv片段(single-chain Fv fragment, scFv)等，并对它们抗狂犬病毒的中和活性进行了深入的研究。赵小玲等[18]使用大肠杆菌表达系统获得人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段(dsFv)，其对狂犬病毒的中和实验结果显示， dsFv可特异的中和狂犬病毒，阻止狂犬病毒对Vero 细胞的吸附，从而抑制靶细胞感染，使蚀斑减少甚至消失。Duan等[19]对人源抗狂犬病毒单抗MAB57构建了单链Fv片断FV57，为增强其稳定性和中和潜力，在此基础上构建了二硫键稳定化的scFv，即ds-FV57 。该片段同样是用大肠杆菌表达系统获得，经RFFIT活性检测和小鼠狂犬病毒挑战模型试验结果证明，它除了具有体外中和活性外，还能对小鼠抵抗狂犬病毒感染提供有效的保护作用。王丁丁等[20]使用分步整合法在巴氏毕赤酵母中表达人抗狂犬病毒全分子抗体，ELISA检测结果显示该抗体具有良好的狂犬病毒抗原结合活性。以上研究中由大肠杆菌和酵母表达系统获得的产物不具有糖基化或糖基化不完全，而这些分子均具有抗狂犬病毒的中和活性。因此有力的证明了在抗狂犬病毒抗体对狂犬病毒的中和作用中，N-糖链可能不是其发挥中和作用必需的结构，中和作用的核心在于抗体可变区对抗原的识别和结合。也就是说，由于切除的N-糖链位于抗体Fc区，而中和活性应该与抗体的Fab区关系更为密切。

同时国内有文献报道显示，如果删除糖链，可使靶抗原结合能力下降。陶磊等[21]对重组嵌合抗CD20 IgG1型单抗糖链切除对其结构与功能的影响进行了研究，研究结果显示切除N-糖链后IgG1型单抗对CD20的抗原结合能力下降，体外CDC活性基本消失，糖链是维持该IgG1型单抗正常结构和功能的重要组成部分。而本研究使用RFFIT检测待测品的抗狂犬病毒中和活性的研究结果则表明，N-糖链切除以及水浴对这两种抗体中和活性均无明显影响。

综上所述，N-糖链对重组单抗的生物学功能的影响因抗体分子不同而机制各异，不能一概而论。尤其对于全新的单抗分子，其结构与功能的关系更是需要进行详细的结构-功能关系研究，才能逐步明晰抗体分子精细结构与具体功能之间的内在联系。

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Effect of the N-glycan Removal on the Neutralization Activity of Recombinant Anti-rabies Monoclonal Antibodies

LV Ruo-yun§, WANG Hui§, CHEN Chen, ZHANG Shi-xiong, ZHANG Xiao-nan, CAO Chen-hua, WEI Jing-shuang*

StateKeyLaboratoryofAntibodyResearch&Development,NewDrugResearchandDevelopmentCompanyLtd.,NorthChinaPharmaceuticalCorporation,Shijiazhuang050015,China

The recombinant anti-rabies monoclonal antibody were fully-human-derived antibody and were used for post-explosure prophylaxis of rabies virus. The N-glycan of two anti-rabies monoclonal antibodies (Mab1 and Mab2) were hydrolyzed by the PNGase in this study, the capillary electrophoresis and gel staining by periodic acid-schiff method were used to determine the residual N-glycan after hydrolysis. The rapid fluorescent focus inhibition test was used to compare the neutralization bio-activity of the intact Mab1 and the Mab2 without N-glycan. The result showed that the neutralization bioactivity of Mab1 and Mab2 did not change after the N-glycan was removed from the antibodies. That suggests the N-glycan was not the indispensable composition for in-vitro neutralization bioactivity of Mab1 and Mab2.

recombinant anti-rabies virus monoclonal antibody; N-glycan removal; capillary electrophoresis; neutralization activity

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.10

2016-05-18; 接受日期：2016-06-12

“十二五”国家科技重大专项(2014ZX09201041)资助。

§吕若芸与王辉为本文共同

。吕若芸，工程师，研究方向为单抗药物纯化与质量研究。E-mail:lvry2010@163.com。王辉，工程师，研究方向为单抗药物纯化与质量研究。E-mail：whui@163.com。*通信作者：魏敬双，正高级工程师，研究方向为生物技术药物研发。E-mail:weijsh@hotmail.com