王 垒 综述 彭贵主 审校

·肾脏移植·

肾移植术后巨细胞病毒感染的早期诊断

王 垒 综述 彭贵主 审校

巨细胞病毒(CMV)感染是肾移植术后常见的并发症，也是影响移植肾/人预后的重要因素。CMV感染潜伏期长、发生率高，因此早期诊断与治疗意义重大。近年来，CMV诊断学取得了显著的进展，包括DNA检测手段的改进、流式细胞术的应用及多种检测技术(如基因诊断与免疫检测)的联合应用。本文就此作一综述。

肾移植 巨细胞病毒感染 早期诊断

巨细胞病毒(CMV)，也称人疱疹病毒5型(HHV-5)，是一种表面有脂质包膜，长度约为230 kb的线状双链DNA病毒，属β疱疹病毒亚科，具有种属特异性。肾移植术后CMV活动性感染发生率为20%～70%，其中15%～35%为有症状的CMV病，致死率高达11%，且多发生在肾移植术后1～4个月[1-3]。

CMV感染既包括无临床症状的抗原血症，也包括CMV病[4]。CMV感染不仅直接引起感染症候群和组织侵袭病，如肺炎、肠炎、肾炎、肝炎；还可间接引起移植物损伤，如急慢性移植物排斥、心脏并发症、肿瘤、移植后糖尿病、淋巴增殖紊乱性疾病等。 CMV常与其他病原体发生二重或多重感染，病情凶险、死亡率高、严重影响肾移植术后受者生存率。另外，研究报道CMV感染还是增加移植肾急性排斥反应的独立危险因素，这可能与预防性抗病毒治疗的时间有关[5]。因此，快速、及时、准确地诊断肾移植术后CMV感染，对临床抗病毒治疗意义重大。

肾脏穿刺活检及病毒培养

虽然肾脏穿刺、组织活检找到病原体成功率极低，且具有损伤性，但仍是CMV感染确诊的金标准之一。

从病变组织中分离出的CMV增殖缓慢，检测周期长(4～6周)，并且阳性率低(长时间培养易受细菌和真菌污染)，但也是诊断CMV感染的金标准，尤其适用于血标本抗原或DNA滴度较低隐性胃肠道侵袭性CMV感染患者。

Shell vial培养技术

直接将标本接种于成纤维细胞单层，24～48h后应用单克隆抗体检测CMV复制时产生的即刻早期抗原。此法适用于组织标本、尿液或呼吸道肺泡灌洗液，但其灵敏度相对降低(<50%)。

影像学检查

肾移植术后受者CMV肺部感染的CT表现有一定的特异性，早期或轻型CMV肺炎表现为间质性肺炎，晚期可见磨玻璃样改变或实变。并且，CT能提供肾移植术后CMV感染与其他感染性疾病的鉴别诊断如侵袭性肺曲霉菌病(IPA)、卡氏肺囊虫肺炎(PCP)及肺结核等。但是，肾移植术后CMV感染的影像学表现常在短时间内迅速发生变化，且常与临床表现不同步，在一定程度上限制了其临床应用。

抗体检测

目前肾移植供、受者常规采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测CMV IgG和CMV IgM，但都不是肾移植术后CMV早期诊断的最佳指标。一方面，虽然CMV IgM反映的是原发感染或活动性感染，但是由于免疫抑制剂的使用，肾移植受者CMV IgM抗体检测通常阳性率极低(2/56)[6]。另一方面，CMV IgG反映的是既往感染，并且缺乏特异性。研究报道CMV IgG阳性率在西方发达国家高达40～60%，在发展中国家接近100%[7-8]。所以，通常认为在肾移植术后CMV感染中CMV IgG滴度升高4倍才有意义。

一般来说，CMV IgG(+)受者接受CMV IgG(+)供者的肾脏通常不会出现CMV感染，但是如果没有接受抗病毒预防治疗仍有20%～30%的患者出现CMV 感染；另一方面，CMV IgG(-)的受者如果没有接受抗病毒预防治疗通常都会出现CMV 感染。但是研究发现30%～40%的患者即使不接受抗病毒预防治疗依然不会出现CMV 感染。因此，单纯的抗体检测预后意义有限。

基因检测

CMV-DNA PCR 抢先治疗是目前肾移植术后CMV感染最为有效的预防策略，其关键是早期及时准确地评估患者体内病毒DNA载量。定性PCR可检出低水平感染的CMV-DNA，敏感度好，但假阳性高。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测速度快，具有较高的敏感度及特异度，是诊断CMV感染的可靠方法，特别适用于CMV-PP65抗原检测阴性的侵袭性CMV肺炎肺泡灌洗液的检查[9]。并且对检测样本没有要求，不受中性粒细胞数量的影响，耗时少，可多个样本一起检测。

目前，通过RT-PCR检测CMV DNA的方法很多，包括分析物特异性研究(ASR)、实验室开发的测试(LDT)、EraGen Multicode、 Focus Simplexa、 Elitech MGB Alert CMV及Abbott CMV等。2011年，WHO把LDT作为CMV PCR检测的标准方法。Binnicker和Espy[10]通过对这6种检测方法的比较分析发现，Abbott、Elitech、EraGen和Focus的敏感度均为100%，而ASR的敏感度为89%，LDT的敏感度为98%。Elitech的特异度为97%、LDT为100%。研究发现，与LDT相比，Cobas能检测更低浓度的CMV DNA[11]，更适合肾移植术后CMV DNA低负荷的检测与监视[12]。

另外，Babady等[11]研究发现Cobas CMV DNA全血的敏感度和特异度分别为85.2%和98.1%，而Cobas CMV DNA血浆敏感度和特异度分别为100%和90.5%。并且，肾移植术后全血CMV DNA含量一般高于血浆。

CMV早期基因 CMV自我复制周期可分为即刻早期(IE)、早期(E)和晚期(L)。相应地，其基因组也分为IE、E和L。其中，即刻早期基因IE2表达产生的调控蛋白IE86是病毒复制所必需的。刘鹏等[13]研究发现肾移植术后IE2阳性率52.5%(21/40)，其中10例(25%)发展为症状性感染。并且，IE2出现阳性的时间早于其他方法，极大缩短了监测的窗口期(7D)，可有效区分潜伏感染和活动性感染。

磷酸化蛋白抗原检测

PP65抗原 CMV-PP65是一种重要的CMV被膜蛋白，其生理功能主要是调节病毒基因表达，改变宿主细胞的生理代谢过程，在不同病毒株中PP65具有高度的保守性。对CMV感染患者进行CMV PP65抗原检测，可在出现临床症状体征的前几天至1周内显示出阳性结果。研究发现只要外周血白细胞中有一个或几个荧光显像表现，即可判断为CMV-PP65抗原检测阳性，辅助临床观察确诊为CMV病[14]。肾移植术后CMV-PP65抗原检测阳性率为48.1%，其中15例(60%)发生CMV感染；并且，CMV-PP65抗原检测首次出现阳性的平均时间明显短于CMV-IgM抗体检测术后首次出现阳性的平均时间(4.2±3.3周vs8.7±5.8周，P<0.05)[15]。目前，CMV-PP65检测是肾移植术后CMV活动性感染的标准之一，同时CMV-PP65抗原血症也是临床启动抗CMV的标志。但是，PP65抗原血症检测要求血液新鲜，4～6h内分析，且结果易受主观性干扰。

PP67 抗原 CMV-PP67是L-mRNA 编码的CMV基质表层蛋白，PP67的L-mRNA可真正反映活动性的CMV感染[16]。研究发现肾移植术后CMV感染组PP67的阳性率高达66.1%，并且PP67出现阳性的时间早于未感染组[17]。

免疫功能监测

肾移植术后受者免疫状态的监测与评估非常重要：一方面，肾移植后受者的免疫状态与移植效果密切相关；另一方面，CMV活动性感染后，病毒通过多种机制影响免疫系统，机体免疫应答状态发生改变直接反映在免疫因子水平和免疫细胞亚群变化上。

甘露聚糖结合凝集素(MBL) 天然免疫分子MBL血清水平低下是机体易患感染性疾病的重要危险因素。MBL能选择性与病原菌表面的糖蛋白结合，通过凝集素途径激活补体系统，可溶解、清除病原菌和免疫复合物；还可与吞噬细胞表面受体结合，直接介导吞噬功能或借补体片段间接调理吞噬作用。白纪民等[18]研究报道肾移植术前血MBL<500 ng/ml的受者术后易发生CMV感染，并且Logistic回归分析发现术前MBL< 500ng/ml 是CMV感染的独立危险因素。

T淋巴细胞亚群 CMV、T、B细胞等单核细胞中复制，因此淋巴细胞的检测对诊断CMV感染十分重要。CMV在体外主要刺激CD8+T细胞增殖，使得CD4+T/CD8+T比值倒置。研究发现，在肾移植术前CMV感染组外周血CD3+CD4+T细胞计数明显低于未感染组；在术后CMV感染患者CD3+CD4+T细胞比例及绝对计数明显降低，CD3+CD8+T细胞比例及绝对计数明显升高，CD4+T/CD8+T比值显著降低[19-20]。然而，并非所有的CD3+CD8+T淋巴细胞都是效应性T细胞(effector T cells,Teff)。其中，CD8+CD28-T抑制细胞是一群抑制性T细胞(suppressor T cells,Ts)，通过抑制T细胞的活化与增殖等诱导移植肾的耐受。这在一定程度上解释了临床上“感染不排斥，排斥不感染”的现象。

自然杀伤(NK)细胞 NK细胞是固有免疫细胞中一类重要的抗病毒感染的效应细胞，研究报道缺乏T细胞的严重联合免疫缺陷 (SCID) 患者NK 细胞可控制CMV 感染[21]，这提示NK细胞参与抗CMV感染过程。NK细胞数量控制 CMV感染细胞表面表达了多种活化性受体和抑制性的受体，两类受体的比例决定了NK细胞的活化和杀伤水平。研究发现NK 细胞重要的活化性分子CD226属于免疫球蛋白超家族成员，是NK细胞表面一种重要的活化型受体，参与NK细胞抗肿瘤和抗感染过程[22]。研究证实外周血CD226+NK细胞比例在肾移植术后CMV感染患者显著降低，在感染恢复期回升[23]。

淋巴细胞代谢标志物——三磷酸腺苷(ATP) ATP是CD4+T细胞的代谢标志物，CD4+T细胞接受外来抗原刺激后，其反应能力的强弱表现为ATP的多少，因此可用ATP数值量化CD4+T细胞的免疫反应能力，从而评估患者的免疫功能。根据ATP含量，患者免疫状态可分为：弱免疫细胞反应(ATP≤225 μg/L)、中免疫细胞反应(ATP 226～524 μg/L)、强免疫细胞反应(ATP≥525 μg/L)。研究发现，肾移植术后发生CMV重症肺炎患者的ATP含量显著低于其他感染的患者[24]。

血浆白细胞介素10(IL-10) IL-10在肾移植术后CMV感染中发挥多重作用，尽管很多机制仍待进一步研究。ELISA是血清或胞质内细胞因子的重要手段。Limaye等[25]研究发现，与肾移植术后未发生CMV病的患者相比，肾移植术后血浆IL-10阳性率明显增高(P<0.05)；该研究还发现IL-10阴性可作为CMV 预防性用药的指标，其敏感度和特异度分别为85%和78%。

CMV特异性免疫应答 CMV特异性的免疫反应在肾移植术后CMV感染中扮演重要的角色，尤其是CMV特异性的T细胞免疫应答。酶联免疫斑点技术(EliSpot)是细胞免疫应答检测的重要手段，可有效检测在CMV感染中发挥主要免疫应答的γ干扰素(IFN-γ)阳性T细胞的数量。

IE2基因表达产生的调控蛋白IE86是病毒复制所必需的调控因子，而EliSpot技术是检测细胞免疫应答最敏感的检测方法。Bestard等[28]发现EliSpot检测肾移植受者术前抗IE-1特异性T细胞免疫应答能很好地预测术后CMV的发生，其曲线下面积>0.70。但在CMV IgG(+)的肾移植受者中结果可能不一样。Kim等[4]研究发现在42例IE1-特异性 ELISPOT阳性的患者中仅14例发生CMV感染，而在27例阴性患者中却有13例发生CMV感染(P=0.22)。产生这种差异的原因可能是后者纳入的研究对象均为CMV IgG(+)肾移植受者。该研究发现IE1-特异性 ELISPOT的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为48%、67%、48%和67%。因此，IE1-特异性 ELISPOT在肾移植术后CMV感染的早期诊断方面的价值仍需进一步研究。

PP65是肾移植术后CMV感染T细胞免疫应答中的另一个重要靶点，并且PP65 特异性T细胞免疫应答能力与CMV病毒血症高度相关。Kim等[4]研究发现48例PP65-特异性 ELISPOT阳性中仅15例发生CMV感染，而21例结果为阴性的患者中有12例发生CMV感染P=0.04)。因此，术前可采用该法预测肾移植术后CMV感染的风险。

细胞因子信号抑制剂(SOCS) SOCS在获得性免疫和天然免疫中均发挥重要的调节作用。SOCS不仅能调节免疫细胞如巨噬细胞和树突状细胞等的免疫活性，还是T、B细胞必要的生长因子和分化因子。另外，SOCS家族两个成员SOCS1和SOCS3作为Toll样受体，参与CMV抗原的识别。其中，SOCS1作为IFNⅠ和Ⅱ的重要阻断剂参与IFN-γ通路的免疫调节，SOCS3则通过调节IL-6和IL-10的分泌和释放参与抗病毒免疫调节。Shin等[29]研究发现，与健康人相比，SOCS1高表达于CMV阳性造血干细胞移植的患者中，尤其是未发生过GVHD的CMV阳性患者中；而SOCS3则相反。因此，未来SOCS的检测可作为移植术后CMV感染诊断的辅助检测手段。

小结：CMV感染仍然是肾移植术后不可回避的话题之一，“普遍预防”或“抢先治疗”是目前各移植中心广泛采用的防治策略。“普遍预防”是无的放矢的无奈之举，而“抢先治疗”的关键在于早期诊断。传统的检测手段比如组织活检、病毒培养在诊断上存在明显的滞后性，未来如果能够联合多项检测手段如CVM DNA 、CMV-PP65、即刻早期基因IE2及免疫学检测技术实现对CMV感染的术前预测和术后监测，必将给CMV防治上带来突破性进展。

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(本文编辑 逸 沐)

Early diagnostics of cytomegalovirus infection after kidney transplantation

WANGLei,PENGGuizhu

ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,InstituteofliverandgallbladderdiseaseofWuhanUniversity,TransplantcenterofWuhanUniversity,HubeikeyLaboratoryofMedicalTechnologyonTransplantation,Wuhan430071,China

The infection of cytomegalovirus (CMV) is one of the most common complications in the post-operative kidney transplantation, and is also one of the key factors of patients and renal grafts’ prognosis. Furthermore, early diagnosis and treatment means a lot to CMV infection because of its long latent period and high incidence. Recently, significant advances have happened on the diagnosis of CMV including the improvement of DNA test, application of flow cytometry and interaction of different methods.

kidney transplantation cytomegalovirus infection early diagnosis

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.03.017

中央高校基本科研业务费专项资金(2042015kf101)

武汉大学中南医院，武汉大学肝胆疾病研究院，武汉大学移植中心，移植医学技术湖北省重点实验室(武汉，430071)

2016-04-05