糖肝康对TAA致糖尿病模型大鼠肝损伤肝脏TLR4表达的影响

钱卫斌1,钱秋海2

(1.日本鸟取大学医学部，日本 鸟取683-8503; 2.山东中医药大学附属医院内分泌科，山东 济南250011)

Effect of Tanggankang on immunohistochemical expression of TLR4 in acute damaged liver rat model

QIAN Wei-bin1,QIAN Qiu-hai2

(1.DeptofMedicine,TottoriUniversity,Tottori683-8503,Japan; 2.DeptofEndocrinology,theAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250011,China)

中国图书分类号：E-332；R282.71；R322.47；R392.11；R575.022； R587.1

关键词:糖肝康；TLR4；免疫组化；动物实验；糖尿病；急性肝损伤

Key words:Tanggankang; TLR4; immunohistochemistry;animal experiment; diabetes; acute damaged liver

糖尿病可累及肝脏缺血缺氧，ALT、AST活性增加，胆红素代谢紊乱，重者可致肝坏死[1-2]；肝损伤又使血糖难控制，二者恶性循环，致糖脂代谢紊乱。有实验证明，肝纤维化等慢性肝病时，TLR4可经NF-κB信号转导通路致肝损伤。本实验采用STZ+TAA造成DM急性肝损伤大鼠模型，观察糖肝康对模型大鼠肝脏TLR4免疫组化表达的影响。

1材料

1.1动物及分组健康♂ Wistar大鼠200只，体质量(200±20) g，由山东中医药大学实验动物中心提供。取Wistar大鼠190只，用2%链脲佐菌素制成糖尿病模型。选取150只成模大鼠进入实验，随机分3大组(n=50)：TAA 100、200、300 mg·kg-1组；每种造模方式随机分5小组(n=10)：模型动物+生理盐水组、模型动物+护肝宁组、模型动物+糖肝康小、中、大剂量组。另取10只正常大鼠作为正常动物+生理盐水组。

1.2药物及试剂糖肝康颗粒：山东中医药大学附属医院药剂科加工，实验时将颗粒水煎煮开后制成糖肝康煎剂；护肝宁：贵州信邦制药股份有限公司，批号20120303041。链脲佐菌素(STZ)：Sigma公司产品，批号020106；硫代乙酰胺(TAA)：上海展云化工有限公司，批号1106017；一抗Anti-TLR4，北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-1375R；SP-9000 HistostainTM-Plus kits免疫组化染色试剂盒，批号20090921，浓缩型DAB试剂盒，批号20091021，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3仪器LXJ-Ⅱ型离心沉淀机，上海第二分析仪器厂生产；LEICA ASP600全自动生物脱水机，LEICA公司生产；OLYMPUS CX51显微镜；LEICA ASP2135病理切片机；医学图像分析系统，型号HPIAS1000，同济医科大学千屏影像工程公司产品。

2 方法

2.1给药模型动物+生理盐水组和正常动物+生理盐水组给予生理盐水ig；模型动物+护肝宁组给予护肝宁混悬液0.04 g·mL-1ig；模型动物+糖肝康小、中、大剂量组分别给予1、2、4 g·mL-1的糖肝康ig。各组给药容积均为10 mL·kg-1。

2.2造模连续给药12周后，TAA 100、200、300 mg·kg-1组分别给予TAA 100、200、300 mg·kg-1腹腔注射，制成糖尿病急性肝损伤模型。

2.3免疫组化检测TLR424 h内用戊巴比妥钠60 mg·kg-1腹腔注射，取血，待测血糖、肝功能。开腹取出肝脏，严格根据免疫组化试剂盒操作，检测肝脏TLR4的表达。

3结果

3.1糖肝康对TAA急性肝损伤模型大鼠血糖、肝功能的影响造模后，模型动物+生理盐水组大鼠的血糖、ALT、AST水平异常升高，与正常动物+生理盐水组相比(P<0.01)。治疗后，模型动物+糖肝康小、中、大剂量组和模型动物+护肝宁组与模型动物+生理盐水组相比，血糖、ALT、AST水平降低(P<0.05或P<0.01)。模型动物+糖肝康大剂量组与模型动物+护肝宁组比较，血糖、ALT、AST水平降低(P<0.05)。模型动物+糖肝康中剂量组与模型动物+护肝宁组比较，ALT水平降低(P<0.05)。

3.2糖肝康对TAA急性肝损伤模型大鼠肝脏TLR4免疫组化表达的影响正常动物+生理盐水组大鼠肝脏KC、血管内皮细胞、胆管上皮细胞及一些肝细胞有微弱TLR4表达。造模后，模型动物+生理盐水组大鼠肝组织TLR4表达明显增加，TLR4染色位于胞质，主要见于窦周，以沿间隔分布的梭形间质细胞表达为主，部分肝细胞、肝窦内皮细胞和胆管上皮细胞的膜上TLR4的表达也有所增强。治疗后，与模型动物+生理盐水组比较，模型动物+糖肝康中、大剂量组窦周梭行间质细胞表达减少，模型动物+护肝宁组和模型动物+糖肝康小剂量组TLR4阳性颗粒表达也减少，模型动物+糖肝康用药组与模型动物+护肝宁组比较，无明显差异。

4讨论

糖尿病肝损伤与氧化应激、炎症因子等因素密切相关。TLR4信号通路激活后，能启动多种炎症因子的转录和合成[3]。已证明，TLR4通过MyD88依赖性信号通路和MyD88非依赖性信号通路激活NF-κB[4-5]，NF-κB参与免疫调控介导炎症和多种生理病理过程的基因转录[6]，导致炎性因子大量表达，参与机体组织、器官的损害。结果显示,模型动物+生理盐水组大鼠血糖、肝功能及肝脏TLR4的表达较正常动物+生理盐水组大鼠明显异常，而糖肝康可改善TLR4在肝脏的表达，对血糖、肝功能的效果优于模型动物+护肝宁组。此外，本研究通过研究糖肝康对不同TAA剂量所致糖尿病急性肝损伤的治疗，效果无差别；且糖肝康与护肝宁相比，差异也无显著性。但糖肝康可明显改善血糖、肝功能，也可降低肝脏TLR4的表达，进而起到保护肝脏的作用。

参考文献

[1]Brownlee M. The pathobiology of diabetic complication: a unifying mechanism[J].Diabetes, 2005,54(6):1615-25.

[2]谭红军,杨林,罗春华,等. 石榴皮鞣质对糖尿病大鼠血脂的影响及对肝脏的保护作用[J]. 医学研究杂志,2012,41(10):80-2.

[2]Tan H J, Yang L, Luo C H, et al. Effects of tannin in Punica granatum L. on blood lipids and its protecting liver ability in diabetic rats[J].JMedRes, 2012,41(10):80-2.

[3]李曼丽，甘华. 高糖对肾小管上皮细胞Toll样受体4表达及其信号通路的影响[J]. 重庆医科大学学报，2010,35(6):857-9.

[3]Li M L, Gan H. Effect of high glucose on the expression of Toll-like receptor 4 and the signal pathway in renal tubular epithelial cells[J].JChongqingMedUniv, 2010,35(6):857-9.

[4]Yamamoyo M, Sato S, Hemmi H, et al. Essentital role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR2 and TLR4[J].Nature, 2002,420(6913):324-9.

[5]Yamamoyo M, Sato S, Hemmi H, et al. TRAM is specifially involved in the Toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway[J].NatImmuol, 2003,4(11): 1144-50.

[6]韩淑英, 姜妍, 王志路, 等. 荞麦花叶黄酮对2型糖尿病大鼠肝损伤及IRS-2、PI3K、NF-κB表达的影响[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(11):1582-6.

[6]Han S Y, Jiang Y, Wang Z L, et al. Effects of flavones of buckwheat flower and leaf of type 2 diabetic rats liver injury and IRS-2, PI3K, NF-κB expression[J].ChinPharmacolBull, 2013,29(11):1582-6.

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)02-0295-02

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.030

作者简介：钱卫斌(1984-)，男，博士生，E-mail：doctorqwb@126.com;钱秋海(1955-)，男，博士，教授，主任医师，研究方向：中西医治疗内分泌代谢性疾病，通讯作者，Tel：0531-68617953，E-mail：qianqiuhai@126.com

基金项目：山东省自然科学基金面上项目(No ZR2012HM093)；山东省中医药科学技术研究项目(No 2011-038)

收稿日期:2015-11-14,修回日期:2015-12-15

网络出版时间：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.060.html

网络出版地址：2016-1-25 15:57