刘　宇， 郭　辉， 高晓梦， 张艳芳， 徐甲坤， 董　平❋❋， 梁兴国

(1. 中国海洋大学食品科学与工程学院, 山东 青岛 266003；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 山东 青岛 266071)



活性中心突变型胃蛋白酶原的酵母表达及高效激活研究❋

刘宇1， 郭辉1， 高晓梦1， 张艳芳1， 徐甲坤2， 董平1❋❋， 梁兴国1

(1. 中国海洋大学食品科学与工程学院, 山东 青岛 266003；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 山东 青岛 266071)

摘要：针对活性中心突变型胃蛋白酶原难以被激活且稳定性差的问题，本文研究了活性中心突变对胃蛋白酶原激活及其稳定性的影响。根据猪胃蛋白酶原A的基因序列设计引物，通过RT-PCR和重叠延伸PCR法分别获得野生型(rPG)和突变型(D32A和D215A)胃蛋白酶原基因片段，其中突变型胃蛋白酶原分别为活性中心关键氨基酸天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)。将野生型和突变型胃蛋白酶原分别在酵母中成功表达，研究其激活、激活后的稳定性和活性情况。研究表明，可以成功地在酵母中表达并纯化野生型和突变型重组猪胃蛋白酶原rPG、D32A和D215A。在pH=2.0条件下，rPG在5 min内即可全部激活，且在37℃具有良好的稳定性，而D32A和D215A需24 h以上才可激活。通过在激活反应中加入野生型胃蛋白酶，D32A和D215A的激活时间可缩短至1 h，虽然激活过程有部分酶原发生降解，但激活后获得的突变型胃蛋白酶可稳定3 d，激活后的突变型胃蛋白酶无蛋白水解活性。研究结果表明，活性中心关键氨基酸突变后的胃蛋白酶原仍可激活，虽然在激活过程中胃蛋白酶原的稳定性差，但激活后产生的胃蛋白酶稳定性良好，这为进一步研究突变型胃蛋白酶提供了可能和保证。……