张　亮，夏蓉蓉，陈梅玲，夏文静，陈俞西

(南京师范大学泰州学院 化学与生物工程学院，江苏 泰州　225300)



铝胁迫下外生菌根真菌对土壤磷的活化

张亮，夏蓉蓉，陈梅玲，夏文静，陈俞西

(南京师范大学泰州学院 化学与生物工程学院，江苏 泰州225300)

摘要：通过在铝胁迫下试验，以马勃(Pisolithus tinctorius，Pt)和乳菇(Lactarius delicious，Ld)为供试菌株，土壤为培养基的唯一磷源，采用液体培养的方法研究菌丝生长、磷吸收、氢离子、草酸和可滴定酸的分泌，以及测定土壤有效磷含量的变化。结果表明，两株外生菌根真菌菌丝的生物量、磷含量、磷吸收量及培养基中草酸分泌量均随着铝离子浓度的升高，表现出“先增高后降低”的趋势，其中在全部铝离子浓度条件下，菌株Pt的生物量均大于Ld，说明Pt的抗铝毒能力强于Ld。此外，培养基中pH逐渐降低，而土壤有效磷含量则逐渐升高，且Pt的活化能力强于Ld。相关分析表明，外生菌根真菌培养基中分泌的草酸与土壤有效磷含量呈显著正相关(r=0.680*，n=11)，推测外生菌根真菌分泌的草酸在活化土壤难溶性磷的过程中起到关键作用。因此，外生菌根真菌的抗铝和溶磷能力与其分泌的氢离子和有机酸有关。

关键词：铝；外生菌根真菌；酸性土壤；磷

0引言

土壤中铝作为金属含量最高的元素，但并不是植物生长所必需的营养元素。我国南方地区长期受到酸雨的影响，土壤酸化严重，致使铝离子在土壤中大量溶出，诱发铝毒对植物生长的危害[1]。磷元素作为植物生长所必需的三大元素之一，大部分地区的土壤磷含量普遍偏低，且有效性不高[2]。我国因酸雨危害的地区多达15个省区，总面积达2 030万hm2，酸雨严重影响植物的正常生长。在酸性土壤中，磷、钾和镁等矿质元素含量低，加上土壤铝的毒害，导致森林植被严重退化[3]。此外，森林植被主要集中分布在南方山区，土层瘠薄，高度风化，土壤长期无法施肥，养分流失严重，加上酸雨的影响，导致大面积的林地凋亡[4]。

多种木本植物可以与外生菌根真菌形成菌根共生体，是森林生态系统重要组成部分。有学者研究表明，植物在形成菌根后，吸收养分的能力显著高于非菌根植物[5]。有研究表明，菌根真菌通过与根系结合形成共生体，增强了植物根系对难移动性元素(如磷)和微量元素的吸收能力，从而促进植物的生长，增强植物抗胁迫环境的能力[6]。另外，研究发现重金属存在的矿区，外生菌根真菌能够积累重金属，而且真菌吸收的矿物质必须通过菌丝套才能进入宿主植物根部，从而缓解了重金属对植物的迫害。因此，外生菌根真菌通过菌丝富集、吸收重金属元素，可能是植物抗金属毒害的途径之一，表现出比无菌根植物更强的耐受性[7]。进一步的研究发现，外生菌根真菌向根际周围释放多种有机酸，其中有草酸、乙酸、柠檬酸等，这些有机酸能电离出氢离子，参与难溶性的磷酸盐活化，使磷酸根释放到土壤中；另外，高分子有机酸通过络合金属离子，形成络合物来活化铁铝磷酸盐[8，9]。有研究表明，在铝胁迫下，多数外生菌根真菌的生物量下降明显，而相应的草酸分泌量和氮磷钾吸收量也受到抑制[10]。但是在铝毒和低磷的条件下，外生菌根真菌对土壤磷的活化的研究未见报道。以南方地区森林低磷黄红壤为供试土壤，探索在铝胁迫下，外生菌根真菌对土壤磷的活化作用。

1材料与方法

1.1材料准备

供试菌株保存于南京师范大学泰州学院微生物实验室，取其中2株作为供试菌株。分别是马勃(Pisolithustinctorius，Pt)和乳菇(Lactariusdelicious，Ld)。采用Pachlewsk固体培养基(去除磷源)培养14d备用。其中培养基配方为：酒石酸铵0.5g、氯化钾0.55g、硫酸镁0.5g、葡萄糖20g、琼脂18g、维生素B10.1g、微量元素混合液1mL(每升含8.45mg H3BO3、5mg MnSO4、6mg FeSO4、0.625mg CuSO4、2.77mg ZnCl2和0.27mg(NH4)2MoO4)、去离子水1L，pH5.5，溶解之后，然后在121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌30min。

供试土壤为酸性黄红壤，采自浙江安吉藏龙百瀑景区马尾松林下的底层土壤。蒸汽灭菌后的土壤参数为：pH4.25、有机质20.5g/kg、全氮1.07g/kg、全磷0.55g/kg、有效磷22.9mg/kg。将土壤自然风干，磨细过100目筛子，然后准确称取1.000g土壤装入到PVC塑料管中，两端用玻璃纤维和微孔滤膜(孔径为0.22μm)封口，并进行高压蒸汽灭菌。在装入培养瓶中，无机离子和水分子可以自由进出，而土壤不会穿过滤膜。

1.2试验设计

试验配置铝离子浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L的无磷Pachlewsk液体培养基，pH4.25；然后在150mL三角瓶中装入20mL培养液，再加入一个装有土壤的PVC塑料管，封口，高压灭菌30min。冷却之后，在每瓶培养液中接种直径为6mm的固体菌种，同时以不接种外生菌根真菌的培养基作为对照处理。每个处理设置5次重复，试验重复进行3次，25℃暗箱培养14d备测有关项目。

1.3测定项目与方法

培养结束后，将菌丝和培养液分离，收集滤液，用精密数字酸度计测定滤液中pH变化，然后采用KMnO4滴定法测定滤液中的草酸含量[11]。用NaOH滴定法测定培养液的总酸度(总酸度指每毫升培养液中全部氢离子的物质量)。用钼蓝比色法测定滤液中磷含量[12]；另外，将菌丝在105℃条件下烘干称重即为每瓶生物量，然后用浓H2SO4和H2O2来消煮菌丝制备消煮液。同时将PVC管中的土壤取出风干，用Olsen法提取，用钼蓝比色法分别测定消煮液磷及土壤中的有效磷含量[13]。

1.4数据处理

用Excel2007对试验数据进行基本计算，SPSS18.0进行统计分析，不同处理间的差异显著性用单因素方差分析进行比较。

2结果与分析

2.1铝对外生菌根真菌生物量、磷含量和磷吸收的影响

2.1.1生物量

外生菌根真菌在不同浓度的铝离子胁迫下，以酸性黄红壤作为Pachlewsk培养基的唯一磷源中生长状况见表1。随着铝离子浓度的升高，两株外生菌根真菌的生物量均表现出先升高，后降低的趋势。其中，两株菌的生物量均在铝离子浓度1mmol/L时达到最大值，然后随着铝离子浓度的升高，生物量降低；且全部铝离子浓度条件下，Pt的生物量均大于Ld。说明Pt对铝离子的敏感度小于Ld。

2.1.2磷含量及磷吸收量

由表1可知，铝浓度在1.5mmol/L时，Pt和Ld两株菌均出最强的吸磷能力，每瓶的吸收量分别为2.23mg(Pt)、3.06mg(Ld)，同时，磷含量也是最高。说明，在培养基无磷源时，外生菌根真菌能从土壤中吸收磷元素，且两株菌的吸收磷的能力存在差异。

表1　铝对外生菌根真菌的生物量、磷含量和吸收量的影响

注：表中每一列的不同字母表示显著差异(P<0.05)。

2.2铝胁迫下外生菌根真菌培养基中pH的变化

由图1可知，培养14d之后，两株外生菌根真菌均显著降低培养基中的pH，并且随着铝浓度的增加，降低效果越显著。其中Ld菌株在铝离子浓度为2.0mmol/L时，降幅最大，与对照(CK)相比，降低1.02个单位。同时，在全部铝离子浓度条件下，菌株Ld的降幅均大于菌株Pt。

图1　培养基中pH的变化(CK表示为不接种，铝浓度为0 mmol/L)Fig.1　The changes in pH in liquid culture mediums. Different letters indicate significant differences at P=0.05

2.3铝胁迫下外生菌根分泌草酸及培养基中可滴定总酸度的影响

由表2可知，培养14d之后，Pt和Ld两株外生菌根真菌的草酸分泌量均随着铝浓度的升高而增加(Pt在铝浓度2.0mmol/L除外)，且由草酸电离出的氢离子表现出相同的规律。其中，Pt所分泌的总氢离子浓度在铝离子为2.0mmol/L时最高，而Ld所分泌的总氢离子浓度在铝离子为1.0mmol/L时最高。与此同时，草酸电离出的氢离子仅占培养基中总氢离子量的2.06%～5.35%(Pt)、1.71%～3.06%(Ld)。

表2　液体培养基中草酸、草酸电离的H+及总H+浓度

2.4铝胁迫下外生菌根真菌对土壤有效磷含量的影响

由图2可知，土壤有效磷的含量因培养基中铝离子浓度和菌株不同而异。与对照组相比，除菌株Ld在铝浓度为0mmol/L外，其余处理均显著提高土壤中有效磷含量。其中，当铝离子浓度为1.5mmol/L时，菌株Pt和Ld使土壤有效磷含量增加最为显著，比对照(不接种)分别增加了36.16%和12.96%。

图2　土壤中有效磷含量变化Fig.2　The changes in available phosphorus in soils

2.5各因素的相关分析

表3可见，培养液中草酸含量与pH值呈极显著负相关(r=-0.849**，n=11)，与土壤有效磷含量呈显著正相关(r=0.680*，n=11)；说明培养基中草酸的分泌促进土壤中难溶性磷向可溶性磷转化，提高土壤磷的有效性。

表3　试验各因素的相关系数

注：*，**分别表示在0.05和0.01水平上相关性达到显著水平。

3结果与讨论

1)研究以酸性土壤为培养基唯一磷源，在铝胁迫下，两株外生菌根真菌(Pt和Ld)均能生长，但生长状况存在差异。其中Pt在全部铝浓度下生物量均高于Ld，说明外生菌根真菌因菌株不同对铝的耐受性存在差异，菌株Pt的抗铝能力明显高菌株Ld。有研究表明，外生菌根真菌能与2/3以上的树木形成菌根共生体，促进植物吸收养分，提高植物的抗铝能力[14，15]。因此，将外生菌根真菌接种到苗木根际周围，形成菌根共生体之后，有利于树木抵抗胁迫环境，缓解森林退化。

2)两株外生菌根真菌随着铝离子浓度的升高，菌丝的磷吸收量表现出“先升高，后降低”的趋势，这说明低浓度的铝离子对菌丝生长可能是有益的，可以促进菌丝从低磷的环境下吸收养分。

3)当铝离子浓度到达2.0mmol/L时，两株外生菌根真菌的生物量、磷吸收量均出现降低。这说明当环境中的铝浓度超过菌丝的耐受性之后，将不利于外生菌根真菌的生长。有研究者发现，外生菌根真菌与根系形成菌根之后，通过外部菌丝的扩展增大吸收面积，进而增强了植物对难溶性元素(如磷、钾)的吸收，缓解重金属的毒害，提高植物抗环境胁迫的能力[16]。

4)培养基中的pH在铝离子的胁迫下显著下降，其中Ld菌株在铝离子浓度为2.0mmol/L时，降幅最大，与对照(CK)相比，降低1.02个单位，与此同时，培养基中的总氢离子浓度也随着铝离子浓度升高而增加。这说明两株外生菌根真菌通过向环境中释放氢离子，活化难溶性磷酸盐。有研究表明，微生物的溶磷作用可能与氢离子分泌有关，当介质pH的降低后，能够溶解羟磷灰石和氯磷灰石等无机磷酸盐[17，18]。

5)当铝离子浓度为1.5mmol/L时，释放到培养液中的草酸浓度最高，Pt为0.38mmol/L，Ld为0.33mmol/L。另外，草酸钙和草酸铁络合物的稳定常数分别为16.3和20.8，草酸络合金属离子的能力非常强，发生反应之后，使难溶性的磷酸盐溶解释放，为植物利用磷钾营养[19，20]。

6)外生菌根真菌分泌的草酸量与土壤有效磷含量呈显著正相关(相关系数r=0.680*，n=11)；说明在铝胁迫下，外生菌根真菌分泌的草酸通过络合铁、镁、铝、钙等金属离子，使难溶性磷向可溶性磷转化，进而提高土壤有效磷含量。

在我国南方大部分地区由于受到环境的污染，土壤酸化严重，伴随着铝离子在土壤中大量溶出，加上森林土壤养分的贫瘠，使外生菌根真菌生长受到抑制，进而树木缺乏养分供给。本研究中，发现外生菌根真菌Pt具有较强的抗铝和耐低磷环境的能力。因此，筛选出既有抗铝作用，又耐低磷(活化能力强)的优良菌株就显得尤为重要。研究其耐胁迫环境的机理，并将其应用到森林退化修复中意义重大。

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文章编号：1004—5570(2016)03-0037-05

收稿日期：2016-03-02

基金项目：江苏省高等学校大学生实践创新创业训练计划项目(201513843015Y)；泰州市科技支撑计划(社会发展)项目(TS018)；泰州市科技支撑计划(社会发展)项目(TS201516)

作者简介：张亮(1987-)，男，硕士，讲师，研究方向：农业微生物与植物营养研究，E-mail：liangzai0061@126.com.

中图分类号：S153.1；S718.81

文献标识码：A

Activation of phosphorus from soil by ectomycorrhizal fungi under aluminum stress

ZHANG Liang,XIA Rongrong,CHEN Meiling,XIA Wenjing,CHEN Yuxi

(School of Chemistry and Bioengineering, Taizhou College, Nanjing Normal University, Taizhou，Jiangsu 225300, China)

Abstract:Pisolithus tinctorius (Pt) and Lactarius delicious (Ld) were cultured in liquid Pachlewsk medium with soil as the phosphorus (P) source under aluminum stress to study the fungal growth, P uptake, efflux of protons, oxalic acid and titratable acid, and changes of soil available P were measured to study P mobilization from soil by ECMFs. The result indicated that the fungal growth, oxalicacid efflux, P concentration and uptake, first increased and then decreased with the increase of the concentration of aluminum. The biomass of Pt was higher than Ld in all aluminum concentration, showed that the resistance to aluminum toxicity of Pt was stronger than Ld. In addition, the pH of culture mediums was decreased gradually with the soil available P increased gradually and the mobilization ability of Pt was stronger than Ld. Correlation analysis shows that oxalic acid exuded by ECMFs was significant positively related to soil available P (r = 0.680*, n = 11), indicated that oxalic acid exuded by ECMFs is primary importance during the process of mobilizing insoluble P in soil. Therefore, the ability to resist aluminum and mobilize P was related to protons and organic acids by ECMFs efflux.

Key words:aluminum; ectomycorrhizal fungi; acid soil; phosphorus