姚广龙，李　乐，邢炎慧，马凤菲，张莉娜，王新广，罗先群

(海南大学 海南优势资源化工材料应用技术教育部重点实验室，海南 海口 570228)



海南全缘褶萼苔内生真菌的分离及抑菌活性的初步研究

姚广龙，李乐，邢炎慧，马凤菲，张莉娜，王新广，罗先群

(海南大学 海南优势资源化工材料应用技术教育部重点实验室，海南 海口 570228)

摘要：研究了海南全缘褶萼苔的表面消毒条件及其内生真菌TX003菌株发酵液的抑菌活性。结果表明，采用75%乙醇浸泡2 min，无菌水冲洗4次，再用5.0%次氯酸钠浸泡5 min，无菌水冲洗4次，是海南全缘褶萼苔表面消毒的最佳条件。其内生真菌TX003菌株发酵液具有广谱抑菌活性，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌抑菌圈直径分别达到17 mm、16 mm、13 mm、8 mm、11 mm。海南全缘褶萼苔内生真菌TX003可以产生具有抑菌活性的次生代谢产物，为新型抗菌药物的筛选提供了新的途径。

关键词：全缘褶萼苔；内生真菌；分离；抑菌活性

苔藓植物是植物界由水生向陆生过渡的高等植物类群，从形态学上可分为苔纲(Hepaticae)、藓纲(Musci)和角苔纲(Anthoeerotae)3类。苔纲约有5 000种，藓纲约有15 000种，角苔纲有近100种[1]。为适应生存环境、保护自己，苔藓植物常能合成某些具有细胞毒、抗菌等活性的次级代谢产物。所以，几乎所有苔藓都不被自然界各种动物和昆虫所摄食，也不被细菌、真菌或病毒所感染。在研究苔藓植物化学成分时发现，萜类、半萜类、联苄、双联苄、黄酮类化合物等生物活性物质使苔藓植物具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等特性[2-5]。

苔藓内生真菌是一类能定殖在苔藓体内靠苔藓来获取营养和保护却不对苔藓产生病害的微生物。20世纪末，研究者发现内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生物活性物质后，内生真菌的研究迅速成为热点[6-7]。作者首次从海南全缘褶萼苔[Plicanthus birmensis(Steph.)R.M.Schust]中分离出内生真菌，经多次分离、纯化，筛选出内生真菌TX003，对其发酵液的抑菌活性进行了初步研究，旨在为海南苔藓植物内生真菌资源的研究提供参考。

1实验

1.1材料与菌种

海南全缘褶萼苔，采自海南省乐东市尖峰岭国家级自然保护区，经海南大学园林园艺学院老师鉴定，凭证标本存放在海南大学生物工程系实验室。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，由海南大学材料与化工学院生物工程系实验室提供。

1.2培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：取去皮马铃薯200 g切成块，煮沸0.5 h后纱布过滤，加入葡萄糖20 g、琼脂粉15～20 g，定容到1 000 mL，pH值自然，于121 ℃灭菌20 min。首次分离内生真菌时在此培养基中加链霉素(50 U·mL-1)抑制细菌生长。

马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB培养基)：取去皮马铃薯200 g切成块，煮沸0.5 h后纱布过滤，加入葡萄糖20 g，定容到1 000 mL，pH值自然，于121 ℃灭菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉15 g，定容至1 000 mL，pH值7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min。

1.3方法

1.3.1海南全缘褶萼苔的表面消毒

除去海南全缘褶萼苔中枯枝和泥沙，洗洁精清洗几遍，纯净水冲洗1 h，将全缘褶萼苔表面水分用无菌纱布吸干，在超净工作台上进行全缘褶萼苔茎表面消毒，用印迹法检验表面消毒效果。

具体过程如下：用75%乙醇浸泡2 min，无菌水冲洗4次；再用5.0%次氯酸钠溶液分别浸泡2～6 min，无菌水漂洗4次，PDA培养基上做印记，28 ℃培养箱中培养5 d，观察平板，若没有微生物长出，说明表面消毒效果良好。

1.3.2内生真菌的分离与纯化

无菌条件下，将表面消毒完全的全缘褶萼苔茎用无菌纱布吸干水分，剪刀剪小后，置于无菌研钵中充分研磨，无菌水稀释，稀释液涂布于PDA 培养基上进行内生菌的分离。长出真菌后，挑取其尖端部分移至新的PDA平板上，28 ℃培养，经反复几次纯化后，即得到全缘褶萼苔内生真菌纯培养物TX001、TX002、TX003、TX004、TX005，于4 ℃冰箱保藏，备用。

1.3.3内生真菌的发酵

将分离得到的TX003内生真菌接种于PDB培养基中，250 mL三角瓶装40 mL培养液，摇床振荡培养(180 r·min-1，25 ℃)7 d。将培养物(发酵液和菌球) 从三角瓶中倒入培养皿，在55 ℃鼓风干燥箱内烘干并称量。研钵中研磨成细粉，以1 ∶10(g∶mL)的比例30 ℃下用丙酮浸渍18 h，再用超声波提取发酵培养物内的化学物质：温度55 ℃，时间30 min，功率300 W。获得海南全缘褶萼苔内生真菌TX003发酵液和菌球的丙酮提取液。

1.4抑菌活性评价[8]

采用双层圆形纸片扩散抑菌法评价抑菌活性。活化受试菌，用接种环刮取一环受试菌于5 mL无菌水中，振荡摇匀，得菌悬液，用涂布棒将平板中的菌液涂抹均匀。取经高压湿热灭菌过的直径为6 mm的圆形滤纸片浸渍丙酮提取液。两片滤纸重叠，分别紧贴在涂布了细菌、真菌菌悬液的培养皿上。细菌37 ℃恒温培养18～24 h，真菌28 ℃恒温培养48～72 h。测量抑菌圈直径，做空白对照实验，3组平行样，取平均值。

2结果与讨论

2.1海南全缘褶萼苔表面消毒最佳条件

海南全缘褶萼苔表面消毒效果如表1所示。

由表1可知，海南全缘褶萼苔茎先用75%乙醇浸泡2 min，无菌水冲洗4次；再用5.0%次氯酸钠浸泡5 min，无菌水冲洗4次，可达到表面完全灭菌，且对内生菌破坏最小，为全缘褶萼苔的表面消毒最佳条件。

2.2海南全缘褶萼苔内生真菌TX003的抑菌活性

海南全缘褶萼苔内生真菌TX003的抑菌活性筛选结果见表2。

由表2可知，海南全缘褶萼苔内生真菌TX003菌株发酵液对5种受试菌(4种细菌、1种真菌)均有较好的抑菌活性。由此可见，海南全缘褶萼苔内生真菌TX003在一些疾病的治疗中有明显的开发利用价值和前景，为新型抗菌药物的筛选提供了新途径。

表1海南全缘褶萼苔表面消毒效果

Tab.1　The surface disinfection results ofPlicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust

注：“-”表示没有菌生长；“+”表示有菌生长，但是生长速度慢；“++”表示菌生长得较好。

表2TX003的抑菌活性筛选结果

Tab.2　Screening results of antibacterial activity of TX003

2.3讨论

(1)目前从海南全缘褶萼苔分离内生真菌多采用其茎部组织，可能是因为茎中含有丰富的营养物质，有利于内生真菌的生长。

(2)金黄色葡萄球菌危害大，是一种常见的病原菌，可引起多种严重感染，如心包炎、肺炎，甚至引发败血症、脓毒症等全身感染。白色念珠菌常侵犯皮肤、粘膜，也可引起内脏或全身感染。海南全缘褶萼苔内生真菌TX003菌株发酵液对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌都有良好的抑菌作用，有望作为人类抗感染药物资源菌而进一步开发。

(3)海南全缘褶萼苔内生真菌TX003菌株发酵液对细菌及真菌的抑菌机制、抑菌活性成分及其化学结构有待进一步研究。

3结论

研究了海南全缘褶萼苔的表面消毒条件及其内生真菌TX003菌株发酵液的抑菌活性。结果表明，采用75%乙醇浸泡2 min，无菌水冲洗4次，再用5.0%次氯酸钠浸泡5 min，无菌水冲洗4次，是海南全缘褶萼苔表面消毒的最佳条件。其内生真菌TX003菌株发酵液具有广谱抑菌活性，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌抑菌圈直径分别达到17 mm、16 mm、13 mm、8 mm、11 mm。海南全缘褶萼苔内生真菌TX003可以产生具有抑菌活性的次生代谢产物，为新型抗菌药物的筛选提供了新的途径。

参考文献：

[1]SCHOFIELD W B.Introduction to Bryology[M].New York：Macmillan Publishing Cpmpang，1985.

[2]朱瑞良,王幼芳,熊李虎.苔藓植物研究进展Ⅰ.我国苔藓植物研究现状与展望[J].西北植物学报,2002,22(2):444-451.

[3]周江渝.苔藓植物的化学活性成分研究概况[J].广西中医学院药学院学报,2002,5(4):84-87.

[4]吴鹏程.苔藓植物生物学[M].北京:科学出版社,1998:357.

[5]汪庆,罗宣.苔藓植物的主要次生代谢产物与有害生物防治[J].贵州科学,2001,19(4):93-100.

[6]戴传超,余伯阳,赵玉婷,等.大戟科4种植物内生真菌分离与抑菌研究[J].南京林业大学学报(然科学版),2006,30(1):79-83.

[7]秦盛,邢珂,吴少华,等.3种仙人掌植物内生真菌抑菌活性的研究[J].中草药,2006,37(6):917-921.

[8]杨璐，蔡寅，姚帅,等.海南两种江蓠不同提取物的抑菌活性[J].化学与生物工程，2015，32(2):40-42.

基金项目：海南省自然科学基金资助项目(3114064，20753073)

>收稿日期：2016-01-31

作者简介：姚广龙(1985-)，男，山东东阿人，讲师，研究方向：热带植物资源开发与利用；通讯作者：罗先群，副教授，E-mail：luoxq35@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.012

中图分类号：R 931.1

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)07-0052-03

Preliminary Study on Separation and Antibacterial Activity of Endophytic Fungi from HainanPlicanthusbirmensis(Steph.) R.M.Schust

YAO Guang-long,LI Le,XING Yan-hui，MA Feng-fei，ZHANG Li-na,WANG Xin-guang,LUO Xian-qun

(KeyLaboratoryofMinistryofEducationforApplicationTechnologyofChemicalMaterialsinHainanSuperiorResources,HainanUniversity,Haikou570228,China)

Abstract：The surface disinfection conditions of Hainan Plicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust and antibacterial activity of its endophytic fungi TX003 fermentation broth were investigated.Results showed that,soaked with 75% ethanol for 2 min,washed with sterile water for 4 times,and then soaked with 5.0% NaClO for 5 min,washed with sterile water for 4 times were the optimum surface disinfection conditions of Hainan Plicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust.The fermentation broth of the endophytic fungi TX003 had broad-spectrum antibacterial activity,and the inhibition zone diameters of Bacillus subtilis,Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,Candida albicans was 17 mm,16 mm,13 mm,8 mm,11 mm,respectively.The secondary metabolites with antibacterial activity could be produced from Hainan Plicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust endophytic fungi TX003.It provides a new way for the screening of new antibacterial drugs.

Keywords：Plicanthus birmensis(Steph.) R.M.Schust；endophytic fungi；separation；antibacterial activity

姚广龙，李乐，邢炎慧，等.海南全缘褶萼苔内生真菌的分离及抑菌活性的初步研究[J].化学与生物工程，2016，33(7)：52-54.