何一博，南丽红，黄　枚，郑燕芳，杨　澜，谢晴晴，李　煌（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

·实验研究·

芍药苷对OGD海马脑片中NLRP3炎症小体介导细胞凋亡的影响

何一博，南丽红，黄枚，郑燕芳，杨澜，谢晴晴，李煌
（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

目的通过新生大鼠氧糖剥夺（OGD）海马脑片模型，观察芍药苷对OGD损伤后的海马脑片中NLRP3炎症小体组成蛋白及其所介导的细胞凋亡的影响。方法将培养14 d的海马脑片随机分为5组：空白对照组、OGD组、芍药苷低剂量组（1μM）、芍药苷中剂量组（10μM）、芍药苷高剂量组（100μM）。除空白对照组外，其他各组海马脑片均吸弃脑片培养液后，加入1 m L PBS，并置于三气培养箱中孵育45 m in后，给予相应的药物干预。24 h后取各组海马脑片分别采用TUNEL法检测细胞凋亡率；RT-qPCR法检测NLRP3炎症小体组成蛋白mRNA的表达情况。结果OGD组较空白对照组NLRP3炎症小体组成蛋白m RNA的表达量和细胞凋亡率均明显增高（P＜0.01），芍药苷干预后NLRP3炎症小体组成蛋白的mRNA表达量和细胞凋亡率均明显低于OGD组（P＜0.01）。结论芍药苷可通过下调OGD海马脑片中NLRP3炎症小体组成蛋白的表达，从而产生抗细胞凋亡的作用。

海马脑片；氧糖剥夺；芍药苷；NLRP3炎症小体；细胞凋亡；脑梗死

脑中风是全球第二大致死性疾病，每年可导致约600万人死亡。近年的研究显示神经元和胶质细胞内的NOD样受体热蛋白结构域3（NOD-like receptor pyrin containing 1，NLRP3）炎症小体可能在缺血性脑中风中扮演着重要角色，炎症小体激活后，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase-1）可随之激活引起细胞凋亡，阻断或抑制NLRP3炎症小体的活化可成为缺血性脑血管病新的治疗靶点［1］。器官型海马脑片因避免了血脑屏障、离子浓度变化、温度、pH值等个体差异的影响，较好保留了组织的结构和完整的神经回路，可模拟体内的生理环境［2］。而海马是脑组织对缺氧最敏感的部位之一，故海马脑片被广泛应用于脑缺氧损伤机制和药物保护作用的研究，已成为较理想的离体缺氧损伤模型。

研究显示，中药对此有一定的效果［3-4］。芍药苷是从毛莨科植物芍药根中提取的具有生物活性的单萜糖苷类成分，已有研究报道其可在缺血性脑损伤中通过抗细胞凋亡而发挥神经保护作用［5］，但有关芍药苷对NLRP3炎症小体介导细胞凋亡的影响目前尚未见相关报道。故本研究拟在建立氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）海马脑片的基础上，观察芍药苷对NLRP3炎症小体组成蛋白的表达及其所介导的细胞凋亡的影响，为芍药苷对脑卒中的治疗作用提供实验依据。

1实验材料

1.1实验动物清洁级P7-9 SD乳鼠由福建中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（闽）2012-0001。

1.2主要仪器Millicell-CM插入式细胞培养皿（美国Millipore公司）；5 000mz型振动切片机（英国Campden Instruments公司）；Forma 371型CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司）；Galaxy CO170R型三气培养箱（美国NBS公司）；LSM710激光扫描共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）；7900HT Fast Realtime PCR System（美国ABI公司）；C1000TM Thermal cycler PCR扩增仪（美国BIO-RAD公司）。

1.3主要试剂MEM培养基（美国Hyclone公司，SH30024）；Hank's平衡盐溶液（美国Hyclone公司，SH30030）；细胞培养用青链霉素（美国Hyclone公司，J130071）；马血清（美国Gibco公司，1296647）；DeadEndTMFluorometric TUNEL试剂盒（美国Promega公司，G3250）；EZgene BiozolRNA Kit（美国BIOMEGA公司，R7311）；HiScript®Q RT SuperMix for Qpcr（+ DNA wiper）（南京Vayzme公司，R123-01）；ChamQTM SYBR®Qpcr Master Mix（南京Vayzme公司，Q311-02/03）。

1.4实验药物芍药苷标准品由上海源叶生物科技有限公司提供，HPLC≥98.5%，批号：23180-57-6。将芍药苷标准品溶于PBS中配成10 mM的母液，-20℃冰箱保存备用，实验时用脑片培养液配成所需浓度。

2实验方法

2.1脑片制备及培养在 Stoppini法［6］的基础上进行改良，取新生7～9 d的SD大鼠，75%酒精擦拭消毒后立即断头取脑，迅速置于0～4℃MEM中，洗尽残留血液与组织液后迅速在解剖显微镜下剥离软脑膜。以大鼠脑离体定位图谱为参照，冠状面切除小脑及以下区域，并沿大脑中线以矢状面将大脑一切为二。在切片机载物台上滴加502胶水，迅速将半脑的冠切面置于胶水上，使脑与载物台面相垂直。载物台随即放入含MEM的振动切片槽中，切片机以1 mm/s的速度冠状面切取400μm厚且含海马组织的脑片，并以细尖嘴镊和软毛刷将海马与周围组织分离，得到完整的海马组织。将组织转移至插入式细胞培养皿（insert）中，每个insert放置3片，并用移液枪小心吸走残留MEM，使脑片处于气液交界面。将insert放入每孔含有1mL脑片培养液的六孔板中（培养液成分：25%HBSS+50%MEM +25%马血清+6.5 g/L D-Glucose+25 mM HEPES，pH 7.2～7.4）。将六孔板放置于饱和湿度、37℃的5%CO2培养箱中培养，每3 d更换1次培养液，培养14 d。

2.2分组、造模与给药海马脑片培养14 d后，倒置相差显微镜下挑选薄厚均匀、透光性良好、结构完整的的海马脑片，将其随机分为5组，每组2个复孔，每个复孔3片脑片。① 空白对照组：不做任何处理，给予脑片培养液1 mL；②OGD组：吸弃脑片培养液后，PBS小心吹洗海马脑片3次，以去除其中残留的含葡萄糖的培养液；将有脑片insert转移至每孔含有1 mL PBS的六孔板中，然后置于94%N2、5%CO2、1%O2、37℃的三气培养箱中孵育45 min后，吸弃PBS，更换为1 mL脑片培养液；于CO2培养箱中继续培养24 h以模拟缺血再灌注。③ 芍药苷低剂量组：按上述方法造模后，吸弃PBS，给予含芍药苷1μM的脑片培养液1 mL。④ 芍药苷中剂量组：按上述方法造模后，吸弃PBS，给予含芍药苷10μM的脑片培养液1 mL。⑤ 芍药苷高剂量组：按上述方法造模后，吸弃PBS，给予含芍药苷100μM的脑片培养液1 mL。给药后各组脑片于CO2培养箱中继续培养24 h。

2.3RT-qPCR法检测NLRP3炎症小体组成蛋白mRNA的表达给药24 h后，以PBS清洗海马脑片，采用Biozol Reagent试剂提取总 RNA。逆转录为cDNA。PCR反应体系20μL，预变性条件为：95℃中变性30 s；循环反应条件为：先在95℃中反应10 s，然后于65℃中反应30 s，循环40次；获取溶解曲线：先在95℃中反应15 s，然后于60℃中反应60 s，最后在95℃中反应15 s。各孔Ct值根据公式RQ= 2^（-△△Ct）计算出各组样品中mRNA的含量：△Ct=目的基因Ct值-内参Ct值，△△Ct=该组别△Ct 值-参考组△Ct值；所得结果取平均值，得到该组的相对mRNA含量（RQ值）。引物由美国Invitrogen生命技术公司合成，NLRP3：F：5’-CCAGACCTCCAA GACCACGACT-3’，R：5’-ATCCGCAGCCAATGAAC AGA-3’；ASC：F：5’-GCACAGCCAGAACAGAACAT -3’，R：5’-CAGAGCATCCAGCAAACCAT-3’；Caspase-1：F：5’-CGTGGAGAGAAACAAGGAGTG-3’，R：5’-TTCAGTGGTTGGCATCTGTAGTC-3’。

2.4TUNEL法检测海马脑片细胞凋亡的情况给药24 h后，严格按照TUNEL试剂盒说明书进行操作，具体步骤：4%多聚甲醛溶液固定海马脑片15 min；PBS洗涤5min；4℃透化过夜；PBS洗涤5 min；4%多聚甲醛溶液再固定5 min；PBS洗涤5 min；将带有海马脑片的半透膜从insert中取下，放置于载玻片上，滴入100μL平衡缓冲液，室温平衡10 min；避光加入50μL TdT反应混合液，并用塑料软膜小心盖住载玻片上的组织；37℃恒温恒湿箱中避光孵育60 min；移去塑料软膜，将脑片避光浸泡在SSC 中15 min以终止反应；PBS洗涤5 min；避光加入100μL DAPI染液，反应10 min；加入封片液，盖上盖玻片。于激光共聚焦显微镜下观察凋亡细胞和拍照。FITC表示凋亡细胞数，DAPI表示细胞总数，按照公式计算细胞凋亡率：细胞凋亡率=［（凋亡细胞数/细胞总数）×100%］。

3结果

3.1芍药苷对NLRP3炎症小体组成蛋白mRNA表达的影响表1和图1～图3所示，与空白对照组相比，OGD组海马脑片中NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表达量明显增多（P＜0.01）；而芍药苷各浓度组干预后海马脑片中的NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表达量均较OGD组明显减少（P＜0.01）。

表1　芍药苷对OGD海马脑片中NLRP3炎症小体组成蛋白m RNA表达的影响（±s）

表1　芍药苷对OGD海马脑片中NLRP3炎症小体组成蛋白m RNA表达的影响（±s）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.01；与OGD组比较，2）P＜0.01。

组别空白对照组OGD　　组芍药苷低剂量组芍药苷中剂量组芍药苷高剂量组NLRP3mRNA相对RQ值1.00±0.00 3.56±0.021）3.12±0.072）1.57±0.052）1.09±0.052）ASCmRNA相对RQ值1.00±0.00 2.20±0.031）1.65±0.022）1.36±0.022）1.12±0.052）Caspase-1mRNA相对RQ值1.00±0.00 2.69±0.031）1.47±0.032）1.03±0.022）0.95±0.032）

3.2芍药苷对细胞凋亡情况由表2和图4所示，与空白对照组相比，OGD组的凋亡细胞数量明显增多，细胞凋亡率明显增高（P＜0.01）；芍药苷各浓度组的海马脑片的凋亡细胞数量和细胞凋亡率均明显低于OGD组（P＜0.01）。

表2　芍药苷对OGD海马脑片中细胞凋亡的影响（±s）

表2　芍药苷对OGD海马脑片中细胞凋亡的影响（±s）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.01；与OGD组比较，2）P＜0.01。

组别空白对照组OGD　　组芍药苷低剂量组芍药苷中剂量组芍药苷高剂量组凋亡率/% 3.49±0.38 52.29±2.671）37.18±1.022）27.71±1.842）17.35±1.222）

4讨论

4.1在正常的生理条件下，为了维持正常的神经功能，脑组织需要持续性的血流以获取足够的葡萄糖和氧气。在缺血性脑中风发生时，必要的血流量下降到极低的水平，脑组织的葡萄糖和氧气供给严重不足，从而在缺血区产生不断恶化的缺血核，引起缺血核心区的神经元死亡以坏死为主，由此而导致的神经功能缺损，是一个不可逆的过程［7］。而缺血周边半暗带区细胞损伤的主要形式为凋亡［8］，细胞凋亡是基因控制的细胞程序性死亡，与梗塞灶的发展扩大关系密切。缺血神经元凋亡具有延迟性，且呈可逆过程，这就为脑缺血的治疗提供了时间，用药物减轻神经元的损伤进而减少脑梗塞范围成为可能［9］。本研究采用的OGD模型可用于模拟缺血性脑中风过程中缺氧缺糖的环境，是一个可用于研究神经保护机制的可靠模型［10］。

近年来，越来越多的研究表明：NLRP3炎症小体的激活在脑缺血再灌注损伤中发挥重要的作用。NLRP3炎症小体是一组复杂的多蛋白复合体，属于胞质内模式识别受体，由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、Caspase-1三种胞质成分组成。NLRP3是NOD样受体家族成员之一，可由外源性微生物及其毒素和内源性危险信号（如缺血再灌注损伤）激活，其通过N端热蛋白结构域（pyrin domain，PYD）与下游 ASC蛋白的PYD区域进行交联，从而允许ASC暴露出的CARD区域与C aspase-1前体的CARD区域结合，从而促进Caspase-1前体的自我剪切，激活C aspase-1。而C aspase-1的多样化效应可介导脑缺血神经元和神经胶质细胞的凋亡，由此形成了NLRP3/ASC/ C aspase-1级联反应通路［11］。

4.2先前已有报道证实芍药苷能迅速透过血脑屏障并到达海马组织［12］，且有研究通过 PI染色法证实芍药苷在炎症诱导的神经损伤过程中具有神经保护作用［13］。本研究结果显示：海马脑片OGD后NLRP3炎症小体组成蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）的mRNA表达量和细胞凋亡率均明显高于空白对照组（P＜0.01），提示海马脑片在OGD 45 min后NLRP3炎症小体被大量激活，从而通过级联反应引起细胞凋亡。给予1μM、10μM和 100μM浓度的芍药苷干预24 h后，NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表达量和细胞凋亡率较OGD组均明显减少（P＜0.01），提示芍药苷对OGD损伤的海马脑片具有抗细胞凋亡的作用，其作用可能与下调OGD海马脑片中NLRP3炎症小体组成蛋白的表达有关。

［1］WEN-HUA Z，XIN W，MALINI N，et al.Fundamental role of the Rip2/caspase-1 pathway in hypoxia and ischemia-induced neuronal cell death［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100（26）：16012-16017.

［2］姚明江，卢树杰，刘建勋.脑片技术在抗脑缺血药理学研究中的应用［J］.中国药理学通报，2009，25（11）：1401-1404.

［3］陈立典，励建安.发展中的中国康复医学［J］.康复学报，2015，25（1）：2-5.

［4］陶静，柳维林，黄佳，等.基于Notch1信号通路观察电针对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血周边皮质与SVZ区神经干细胞增殖的影响［J］.康复学报，2015，25（3）：23-34.

［5］ RUO-BING G，GUO-FENGW，AN-PENG Z，et al.Paeoniflorin protects against ischemia-induced brain damages in rats via inhibiting MAPKs/NF-κB-mediated inflammatory responses［J］. Plos One，2012，7（11）：e49701.

［6］STOPPINI L，BUCHS P A，MULLER D.A simple method for organotypic cultures of nervous tissue［J］.Journal of Neuroscience Methods，1991，37（2）：173-182.

［7］MEHTA S L，NAMRATTA M，RAM R.Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics［J］.Brain Research Reviews，2007，54（1）：34-66.

［8］FERRER I，PLANAS A M.Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia：life and death struggle in the penumbral［J］.JNeuropathol Exp Neurol，2003，62（4）：321-329.

［9］ ZHANG F，YINW，CHEN J.Apoptosis in cerebral ischemia：executional and regulatory signaling mechanisms［J］.Neurol Res，2004，26（8）：835-845.

［10］KONRATH E L，SANTIN K，NASSIF M，et al.Antioxidant and pro-oxidant properties of boldine on hippocampal slices exposed to oxygen-glucose deprivation in vitro［J］.Neurotoxicology，2008，29（6）：1136-1140.

［11］MARIATHASAN，NEWTON K，MONACK D M，et al.Differetial activation of the inflammasome by easpase-1 adaptors ASC and Ipaf［J］.Nature，2004，430（6996）：213-218.

［12］XIHUIH，DONGMING X，YID，et al.Determination of paeoniflorin in rat hippocampus by high-performance liquid chromatography after intravenous administration of Paeoniae Radix extract［J］.Journal of Chromatography B，2004，802（2）：277-281.

［13］NAM K N，CHE G Y，HONG JW，et al.Paeoniflorin，a monoterpene glycoside，attenuates lipopolysaccharide-induced neuronal injury and brain microglial inflammatory response［J］.Biotechnology Letters，2013，35（8）：1183-1189.

R285.5

A

1000-338X（2016）02-0025-04

2016-02-10

福建省卫生和计划生育委员会资助课题（WZZY201302）；福建省教育厅课题（JA15245）；福建中医药大学校管课题（X2014143）

何一博（1990—），男，2013级药理学专业硕士研究生，主要从事中药神经药理研究。

黄枚（1966—），女，教授。E-mail：hmei0303@qq.com