徐岩岩，李铁军，华美红，薛紫梦，刘 盼，李 洁

(河北民族师范学院生物系，河北 承德 067000)

精制竹醋液防治平菇细菌性褐斑病药效试验

徐岩岩，李铁军，华美红，薛紫梦，刘 盼，李 洁

(河北民族师范学院生物系，河北 承德 067000)

测定不同浓度的精制竹醋液对平菇细菌性褐斑病菌的抑制作用以及对平菇菌丝生长的影响以及田间验证。结果表明10%精制竹醋液不仅具有明显的抑菌效果而且能促进平菇菌丝的生长。研究结果为精制竹醋液作为平菇细菌性褐斑病的防治药剂研发奠定基础。

精制竹醋液；平菇；褐斑病；托拉斯假单胞杆菌

平菇(Pleurotusostreatus)具有较高的营养价值，不仅含有多种氨基酸、维生素以及各种对人体有益的酶类，还含有多种生物活性物质，如多糖、多肽等，具有滋补提高机体免疫力等功效[1]。20世纪70年代初，平菇栽培技术出现重大突破，使得平菇生产发展迅猛，成为我国栽培量最大的食用菌[2]。在平菇种植过程中病虫危害是造成减产的主要原因，尤其是平菇细菌性褐斑病破坏菇盖表皮组织细胞，表面出现黄褐色病斑，影响了其商业价值[3]。

平菇细菌性褐斑病的病原菌是托拉斯假单胞杆菌(PseudomonastolaasiiPaine)[3-4]。目前，各种化学农药在防治平菇细菌性褐斑病的过程中农药残留问题不易解决，也没有抗性较好的平菇品种出现，现阶段寻找绿色农药在食用菌病害防治过程中为大势所趋。

竹醋液是是烧制竹炭的副产品，具有特殊的烟熏气味，颜色为淡黄至红褐色，成分复杂，主要是有机酸、酚类、酮类、醇类和酯类[5]。竹醋液以其纯天然、绿色、安全等优势得到推广，可应用于农业、林业、畜牧业、食品加工和医药卫生等方面[6]。

本试验将精制竹醋液应用于平菇细菌性褐斑病的防治，结合室内抑菌毒力试验的方法[7]，测定不同浓度的精制竹醋液对托拉斯假单胞杆菌的抑制作用以及对平菇菌丝的生长调节作用，并从中测得精制竹醋液的最佳抑菌浓度，在田间实现防效验证，旨在为精制竹醋液在平菇细菌性褐斑病的防治的推广提供科学用药的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试平菇品种 “新育冬丰”平菇菌种及菌棒，由平泉县希才应用菌科技发展有限公司提供。

1.1.2 供试病原菌株 托拉斯假单胞杆菌从发生细菌性褐斑病的平菇子实体上分离获得。

1.1.3 供试药剂 硫酸链霉素可溶性粉剂(streptomycin, 效价1 000 U·mg-1)为江西博莱大药厂产品，精制竹醋液为江阴中炬生物技术有限公司提供。

1.1.4 培养基 LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，琼脂18 g，用于培养细菌。LB培养液：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，用于培养细菌。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 托拉斯假单胞杆菌菌悬液的制备 挑取托拉斯假单胞杆菌单个菌株，接种在LB培养液中170/min振荡培养36 h，用无菌水配制成浓度为1×108cfu·mL-1的菌悬液，备用。

1.2.2 平板扩散法抑菌 取100 mL LB培养基微波炉融化后，待温度降至65 ℃，在无菌条件下，倒入已灭菌的培养皿中制作平板，每皿25 mL，冷却至凝固。将100 μL浓度为的1×108cfu·mL-1的托拉斯假单胞杆菌菌悬液加到培养基上，涂布均匀，晾干，打孔8 mm×8 mm，每皿4孔，加入100 μL药剂，37 ℃黑暗培养2 d，每隔24 h记录一次，测定抑菌圈直径。设置无菌水对照和链霉素(0.5 mg·mL-1)药剂对照处理。每组处理3个重复。

1.2.3 最佳抑菌浓度筛选 利用无菌水将精制竹醋液分别稀释至浓度梯度为50%，20%，12.5%，10%，5%，然后利用平板扩散法筛选出精制竹醋液抑菌剂的最佳抑菌浓度，设置无菌水和链霉素对照。

1.2.4 精制竹醋液对平菇菌丝生长的影响 采用平板抑菌法检测不同浓度的精制竹醋液对平菇菌丝生长的影响，设置无菌水和链霉素对照。在无菌操作下，取100 mL PDA培养基微波炉融化后，待温度降至65 ℃，倒平板，每皿25 mL，冷却。取100 μL精制竹醋液抑菌剂均匀涂布在平板上，至完全吸收。在无菌操作下，用打孔器从菌种皿取材，在外缘生活力比较强的菌落处取6 mm×6 mm菌饼，备用。将打好的菌饼放置在平板中央，26 ℃培养8 d。培养8 d后，用“十字交叉法”测定平菇菌丝生长直径，以平均值代表菌落直径。

1.2.5 田间试验 涂抹接种法：待平菇子实体直径5 cm左右开始进行试验。将精制竹醋液均匀喷雾于生长情况一致的幼小子实体菌盖上。4 h后，用灭菌的刷子占取2 mL托拉斯假单胞杆菌菌悬液，均匀涂布在已喷施竹醋液的菌盖上。在接种后，每隔24 h进行一次病级的调查。设置无菌水、链霉素与只接种托拉斯假单胞杆菌对照。参考Rodriguez Estrada & Royse等(2007)[8]的分级标准调查病情指数。

病情指数= Σ(各级病菇数×相应级数)/(调查总菇数×9)×100

防治效果=[ 病原菌对照的病情指数-(处理的病情指数-未接病原菌对照的病情指数)]/病原菌对照的病情指数×100%

1.2.6 数据处理方法 采用IBM SPSS Statistics 19.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度精制竹醋液的抑菌效果

不同浓度精制竹醋液均可不同程度的抑制托拉斯假单胞杆菌的生长。不同浓度精制竹醋液的抑菌效果达到差异极显著(P<0.05)，且浓度与抑菌效果与成比，即精制竹醋液浓度越大，抑菌圈直径也越大。其中，精制竹醋液原液的抑菌圈达到最大，为36.06 mm，抑菌效果最显著。

表1 不同浓度精制竹醋液对托拉斯假单胞杆菌的抑菌圈直径的影响

“-”表示没有抑菌圈; 不同小写字母表示处理间的差异达到显著水平，P<0.05

“-” present no inhibition zone; different lower case letters indicate a significant difference atP<0.05

图1 不同浓度精制竹醋液对托拉斯假单胞杆菌的抑菌圈直径的影响Fig.1 Effect of the refined bamboo vinegar at various concentrations on the diameter of inhibition zone of Pseudomonas tolaasii

2.2 不同浓度精制竹醋液对平菇菌丝生长的影响

精制竹醋液对平菇菌丝具有显著的生长调节作用。为了探讨精制竹醋液对平菇菌丝生长的影响，在培养基中加入不同浓度精制竹醋液，测定了其对平菇菌丝生长的影响，。与空白组对照和链霉素对照相比，发现精制竹醋液原液和50%精制竹醋液对平菇菌丝生长有明显的抑制作用，其余浓度下的精制竹醋液均表现为促进作用，其中12.5%精制竹醋液的促进作用最为显著，平菇菌落直径可达82.67 mm，具有显著差异(P<0.05)。

表2 不同浓度精制竹醋液对平菇菌丝生长的影响

“+++”表示菌落整齐，菌丝洁白、浓密、有弹性；“++”表示菌落整齐，菌丝洁白、较浓；“+”表示菌落不整齐，菌丝灰白、稀疏，不同小写字母表示处理间的差异达到显著水平，P<0.05

"+++" present neat colonies, white, thick and elastic hyphae; "++" present neat colonies, white, thick hyphae; "+" present no neat colonies, pale hyphae; Different lower case letters indicate a significant difference atP<0.05

2.3 精制竹醋液对平菇细菌性褐斑病田间防治效果

在田间试验中，证实了精制竹醋液对平菇细菌性褐斑病的发生确实有较好的防治效果，但较高的浓度(原液、50%、20%)会对平菇子实体产生药害，导致子实体卷曲。对照药剂链霉素病情指数为30.36，防效为69.64%，10%精制竹醋液防效可达79.64%，防治效果优于链霉素。只接致病菌的平菇子实体发病较严重，病斑面积较大，颜色呈深褐色，随着接种时间病斑逐渐扩展至整个菌盖表层。

表3 精制竹醋液对平菇细菌性褐斑病田间防治效果

“+”代表药害程度，“-”代表无药害；不同小写字母表示处理间的差异达到显著水平，P<0.05

"+" present phytotoxicity level, "-" present no phytotoxicity; Different lower case letters indicate a significant difference atP<0.05

3 讨 论

目前国内外平菇细菌褐斑病的防治主要是栽培过程中使用化学药剂如农用链霉素、金霉素[9]、春日霉素[10]、漂白粉液[11]和溴硝醇(bronopol)[12]等。平菇子实体生长期比较短，一旦使用化学药剂，药剂残留来不及降解，危害人体健康。随着生活水平的提高，人们越来越重视食品安全，所以用药需选用低毒、绿色环保、高效和特异性强的抑菌剂防治细菌性褐斑病，防止对人体或平菇本身造成农药危害，这对保证食用菌安全及食用菌产业发展具有重要意义。竹醋液作为竹业生产的副产品，生产成本低廉，本试验中使用的竹醋液经重蒸，除去了焦油，重金属等杂质，提高了竹醋液的纯度。综合上述实验结果，我们认为10%精制竹醋液不仅有显著的抑菌效果与田间防治效果，且可作为平菇生长调节剂促进平菇菌丝的生长。因此，纯植物源的精制竹醋液, 以其高活性、无毒、无残留等特点[13]，在食用菌病害防治与栽培方面具有广阔的应用前景。

[1] 刘巧宁. 五中培养料对平菇栽培的影响研究[D]. 郑州: 河南农业大学, 2013.

[2] 申进文, 吴婷婷, 庄庆利, 等. 平菇栽培过程中胞外酶活性变化[J]. 食用菌学报, 2010, 17 (2) : 56-59.

[3] 金丹, 李宝聚, 石延霞, 等. 一种平菇褐斑病病原菌的鉴定[J]. 食用菌学报, 2009.16 (1)：89-91.

[4] Brodey C L, Rainey P B, Tester M,etal. Bacterial blotch disease of the cultivated mushroom is caused by an ion channel forming lipodepsipep tide toxin[J]. Molecular Plant Microbe Interactions,1991, 4(4): 407-411.

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The Pesticide Effect of Refined Bamboo Vinegar on Brown Blotch Disease ofPleurotusostreatus

XU Yan-yan, LI Tie-jun, HUA Mei-hong, XUE Zi-meng, LIU Pan, LI Jie

(Department of Biology, Hebei Normal University for Nationalities, Chengde 067000, Hebei, China)

Plate and field efficacy tests were conducted to evaluate the effects of refined bamboo vinegar at various concentrations on the brown blotch disease ofPleurotusostreatuscaused byPseudomonastolaasii. The results showed that the refined bamboo vinegar at 10% concentration not only had obvious antibacterial effect, but also promoted the growth of mushroom mycelia. This indicated that the refined bamboo vinegar can be used as an antibacterial agent of the brown blotch disease ofPleurotusostreatus.

Refined bamboo vinegar;Pleurotusostreatus; Brown blotch disease;Pseudomonastolaasii

2015-12-10

河北省科技厅资助项目(13226511)；承德市财政局资助项目(CZ2013007)；承德市科学技术研究与发展计划项目(20157029)

徐岩岩(1985-)，女，讲师，博士，从事农业微生物学方面研究。E-mail：xuyanyan_sd@163.com。通信作者：李洁(1962-)，女，教授，硕士，从事食用菌资源开发利用研究。E-mail：lijie0651@163.com