柳朝阳，张鹏霞，荣光影，张　涛

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)



川芎嗪对 AD模型小鼠脑内APP和NEP表达的影响①

柳朝阳，张鹏霞，荣光影，张涛

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

摘要：目的：探讨川芎嗪(TMP)对AD模型小鼠学习记忆及脑内β淀粉样前体蛋白(APP)和脑啡肽酶(NEP)表达的影响。方法：腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝制备AD 模型小鼠。Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力；免疫组化法检测脑内APP和NEP蛋白的表达。结果：低、高剂量TMP组均能改善 AD小鼠的学习记忆能力(P<0.01),下调小鼠海马APP蛋白表达(P<0.01),上调NEP蛋白的表达(P<0.01)。低、高剂量TMP组相比无明显差异。结论：TMP可改善AD小鼠学习记忆能力, 可能与降低APP及增加NEP蛋白表达有关。

关键词：川芎嗪；AD模型小鼠；β-淀粉样前体蛋白；脑啡肽酶

阿尔茨海默病是一种中枢神经系统进行性退行疾病,即老年性痴呆[1，2],主要病理学特征是在大脑皮层和海马区域形成大量的老年斑(SP)。SP主要成分是β淀粉样蛋白(Aβ )。Aβ的神经毒性在AD发生发展中起了核心作用[3]。Aβ由β淀粉样前体蛋白(APP)水解而成。研究表明, APP和 Aβ 的过度生成是AD重要发病机制[4]脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)是脑内最重要的天然Aβ降解酶,在Aβ的水解过程中发挥关键酶的作用[5]。因此,通过减少APP的生成和上调NEP活性来降低Aβ水平可以预防和治疗AD。本实验观察TMP对AD小鼠的学习记忆能力及脑内APP及NEP蛋白表达的影响，探讨TMP对AD的治疗作用。

1材料和方法

1.1实验动物

实验采用清洁级昆明种系小鼠，6～8周龄，体重 25～30g，佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2主要试剂

磷酸川芎嗪片；D-半乳糖；石杉碱甲；一抗兔抗小鼠APP、兔抗小鼠 NEP抗体购；二抗PV-6001； SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒(以上试剂均购于武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1模型的建立[6]和给药方法

将小鼠50只随机分为 5组(每组10只)：正常对照组、AD模型组、石杉碱甲组(0.02mg kg-1·d-1, 双蒸水配制)、低剂量TMP组(100mg kg-1·d-1)(L-TMP组)、高剂量TMP组(200mg kg-1·d-1)(H-TMP组) 。

AD模型组和给药组腹腔注射D-半乳糖120mg kg-1·d-1和灌胃三氯化铝10mg kg-1·d-1，连续90d，制备AD小鼠模型，正常对照组灌胃和腹腔注射生理盐水，低、高剂量TMP组从第51天开始灌胃药物, 模型组灌胃生理盐水, 连续40d。

1.3.2隐蔽平台试验

从第86天起, 进行 Morris 水迷宫试验[7],连续5d。隐蔽平台固定水迷宫象限中央，将小鼠在任一个象限内的随机位置头朝外放入水中，小鼠爬到平台上到达100秒时，实验停止。潜伏期记为100秒，每天训练 4 次，间隔 20min。用影像记录小鼠寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期。数据由Morris水迷宫图像处理系统处理。

1.3.3空间探索实验

撤去平台, 随机选1个位置放小鼠入水中,小鼠就会找寻记忆中的平台, 记录小鼠在100s内的运动轨迹、原平台象限停留的时间和穿越原平台的次数。

1.3.4免疫组化法检测小鼠海马APP和NEP蛋白的表达

取小鼠海马组织甲醛固定,乙醇脱水、石蜡包埋,制片。切片脱蜡,高压修复抗原 ,滴加一抗,37℃2h,滴加二抗,DAB显色,苏木素复染,脱水,封片。DAB显色后Aβ、APP 阳性细胞为棕黄色。在 APP和NEP染色的海马区分别找 3 个视野(×400), 应用图像分析系统测量每个视野内 APP、NEP阳性细胞数。

1.4统计学方法

2结果

2.1隐蔽平台试验结果

与正常对照组相比, AD模型组的小鼠从第 1 天开始逃避潜伏期即缩短(P<0.05或P<0.01),表明长期注射D-半乳糖可引起小鼠的学习记忆显著下降。

与AD模型组相比，从第3天起，TMP各组和石杉碱甲组的逃避潜伏期明显缩短(P<0.05 或P<0.01),说明药物可以提高AD小鼠的学习记忆能力。TMP各组与石杉碱甲组相比无显著差异(P>0.05)，TMP各组之间相比无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1　各组小鼠隐蔽平台实验潜伏期，单位:s)

注：与对照组相比a)P<0.05，b)P<0.01；与AD模型组相比c)P<0.05,d)P<0.01；与石杉碱甲组相比e)P<0.05。

2.2空间隐蔽平台试验结果

正常对照组、石杉碱甲组和TMP各组大部分小鼠在原平台象限内运动, 其次在与原平台象限相邻的位置象限较多地运动,模型组小鼠一般都随机围绕池壁在各象限中运动。

与AD模型组相比, 正常对照组、石杉碱甲组和TMP各组在原平台象限停留时间和穿越原平台次数均明显增加(P<0.05或P<0.01)，提示TMP能增强AD模型小鼠的记忆能力。TMP各组与石杉碱甲组相比无显著差异(P>0.05)，TMP各组之间相比无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2　各组小鼠空间探索试验

注：与对照组相比a)P<0.05，b)P<0.01；与AD模型组相比c)P<0.05,d)P<0.01；与石杉碱甲组相比e)P<0.05。

2.3免疫组化APP和NEP蛋白的表达

与正常对照组相比，AD模型组小鼠海马组织APP阳性细胞数明显增加(P<0.01)；NEP阳性细胞数明显减少(P<0.01)；与AD模型组相比, 石杉碱甲组和TMP各组 APP阳性细胞数明显减少(P<0.01，P<0.05) ，NEP阳性细胞数明显增加(P<0.01，P<0.05),TMP各组与石杉碱甲组相比，APP和NEP阳性细胞数差异均无显著性(P>0.05)。提示TMP能减少APP的表达和增加NEP的表达。见表3。

表3　各组小鼠海马APP和NEP表达阳性细胞数±s)

注：与对照组相比a)P<0.05，b)P<0.01；与AD模型组相比c)P<0.05,d)P<0.01；与石杉碱甲组相比e)P<0.05，f)P<0.01。

3讨论

逃避潜伏期是隐蔽平台试验中的反映动物空间记忆，即学习能力的实验；空间探索试验是测定动物记忆保持能力[5]。研究结果显示，与正常对照组相比，AD模型小鼠逃避潜伏期明显延长, 停留在原平台象限的时间明显缩短，穿越原平台次数明显减少，表明AD小鼠学习能力和记忆保持能力明显降低。与AD模型组相比，石杉碱甲组和TMP 各组小鼠的逃避潜伏期明显缩短, 停留在原平台象限的时间明显延长，穿越原平台次数明显增加， 表明经TMP治疗可以显著改善AD小鼠的学习能力和记忆保持能力。本实验应用免疫组化法检测海马组织APP和NEP蛋白表达的结果中显示：与正常对照组相比，AD模型组小鼠海马组织APP阳性细胞数明显增加；NEP阳性细胞数明显减少；与AD模型组相比, 石杉碱甲组和TMP各组 APP阳性细胞数明显减少，NEP阳性细胞数明显增加。以上结果说明, TMP可以通过降低脑内APP的表达和增加NEP表达，改变Aβ的代谢，减少Aβ生成，在一定程度上抑制Aβ聚集，从而延缓AD小鼠大脑病理进程，减少Aβ对脑细胞神经元的损伤，从而延缓AD小鼠大脑病理进程，改善小鼠学习记忆能力，为TMP临床治疗AD提供可行性依据。

参考文献：

[1]杜红蕾，宋春雨，魏春杰，等. 神经干细胞对 AD 大鼠行为及突触素Ⅰ表达的 影响[J].黑龙江医药科学，2016，38(3):1-3

[2]朱秋双，任春清，包利泽，等.何首乌对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的作用[J].黑龙江医药科学，2011， 34(3):8-9

[3]陆晓红，李洪刚，秦丽红，等.依达拉奉对阿尔茨海默病大鼠海马神经元晚期糖基化终末产物的影响[J].黑龙江医药科学，2012，35(3):55-56

[4]Zhang YW , Xu H.Molecular and cellular mechanismsfor Alzheimer′s disease:unde rstanding APP metabolism[J].Curr Mol Med , 2007，7(7):687-696

[5]Iwata N, Takaki Y, Fukami S, et al.Region-Specific of a beta-degradingendopeptidase,neprilysin, inmouse hippocampus upon aging[J]. J Neu-rosci Res, 2002，70(3):493-500

[6]Deng HB, Cui DP, Jiang JM , et al.Inhibiting effects of Achyranthes bidentata polys accharide Lycium barbarumpolysaccharide on nonenzyme glycation in D-galactose in-duced mouse aging model[ J] .Biomed Environ Sci, 2003, 16(3):267-275

[7]刘洁生，陈式，谢丽玲，等. K-银环蛇毒素对小鼠被动学习和空间记忆的影响[J]. 卫生研究，1998，27:94-96

基金项目：①1.黑龙江省卫生厅科研项目，编号：2009-336；2.黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目，编号：1252G059；3. 黑龙江省自然科学基金资助项目，编号：H2015074；4.佳木斯大学科技重点项目，编号：Sz2011-009。

作者简介：柳朝阳(1971～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任医师。 通讯作者：张涛(1971～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士研究生导师。E-mail：ztlzy1971@163.com。

中图分类号：R749.16

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)03-0008-02

(收稿日期：2015-02-20)