王洋,罗丽,李晓泓,赵鹏飞,章庆庆,朱世鹏,张玲,申松希,齐丹丹,杨佳敏,沈小雨,郭孟玮,赵雅芳,嵇波,任晓暄,张露芬,朱江,李凯歌,谭莉华(.北京中医药大学针灸推拿学院,北京 0009;.泸州医学院附属医院,泸州 646000;3.北京中医药大学,北京 0009;4.中国中医科学院广安门医院,北京 0003;.南京中医药大学第二临床医学院,南京 0046)



针刺关元穴对寒凝证类痛经大鼠扭体反应和血管舒缩物质的影响

王洋1,罗丽2,李晓泓1,赵鹏飞3,4,章庆庆1,朱世鹏5,张玲1,申松希1,齐丹丹1,杨佳敏1,沈小雨1,郭孟玮1,赵雅芳1,嵇波1,任晓暄1,张露芬1,朱江1,李凯歌1,谭莉华1
(1.北京中医药大学针灸推拿学院,北京 100029;2.泸州医学院附属医院,泸州 646000;3.北京中医药大学,北京 100029;4.中国中医科学院广安门医院,北京 100053;5.南京中医药大学第二临床医学院,南京 210046)

【摘要】目的观察针刺关元穴对寒凝证类痛经大鼠镇痛效应及血管舒缩物质的影响。方法本实验用注射苯甲酸雌二醇和缩宫素再结合全身冷冻的方法制备寒凝证类痛经大鼠模型,观测大鼠扭体反应(扭体潜伏期、扭体次数、扭体评分),并用酶联免疫吸附法测定血浆TXB2和6-keto-PGF1a含量。结果与盐水组比较,模型组扭体潜伏期明显缩短,扭体次数明显增多,扭体评分明显升高(P＜0.01);与寒凝证类痛经模型组比较,针刺组扭体潜伏期均明显延长,扭体次数均明显减少,扭体评分均明显降低(P＜0.05,P＜0.01)。与盐水组比较,模型组血浆6-keto-PGF1a含量明显降低(P＜0.05);血浆TXB2含量有上升趋势(P ＞0.05)。与模型组比较,针刺(关元)组血浆6-keto-PGF1a含量有升高趋势(P＞0.05);血浆TXB2含量有降低趋势(P＞0.05)。结论寒凝证类痛经大鼠血液中血管舒缩物质出现明显紊乱。针刺关元穴可在改善痛经大鼠扭体反应缓解痛经程度的同时,良性调节TXB2及6-keto-PGF1a。血管舒缩物质可能是针刺防治痛经的重要物质之一。

【关键词】针刺;穴,关元;寒凝证;痛经;扭体反应;血管舒缩物质;大鼠

中医学理论认为痛经的核心病机是胞宫“瘀”阻,其中寒凝“瘀”阻占据比例较高,针灸具有活血化瘀作用,治疗痛经有良效。大量研究已发现,“瘀”阻与血管舒缩物质密切相关[1]。虽然我们前期的研究已证明针刺对寒凝证类痛经的防治作用[2],但确切的机制尚不完全清楚。本研究试图从血管舒缩物质的角度,探寻寒凝造成胞宫“瘀”阻痛经状态下大鼠子宫的痛经程度及针刺关元穴对其的影响,揭示针刺对寒凝证类痛经镇痛效应的部分机制,以期为寒凝型痛经的针刺治疗提供新的实验依据。

1　材料与方法

1.1动物与分组

采用清洁级SD大鼠,雌性,鼠龄3个月,体重(240 ±20)g,性成熟未交配,由北京军事医学科学研究院提供,合格证号为SCXK2007-004(军)。饲养条件为室内温度(23±1)℃,湿度(45±5)%,日光灯光照,普通清洁级鼠饲料,自由饮用自来水。

在饲养过程中,通过阴道涂片[3]法,每日定时用细棉签蘸以生理盐水湿润后轻轻插入大鼠阴道约0.5 cm,稍微转动后取出,将带有阴道内容物的细棉签在载玻片上均匀转动涂片,在空气中干燥。美兰染色10 min,用清水将美兰轻轻冲掉,然后在显微镜下观察阴道涂片的组织学变化,根据细胞形态、种类及数量筛选出处于动情间期的3月龄SD雌性大鼠24只,采用随机数字表法将大鼠分为盐水对照组(简称盐水组)、寒凝证类痛经模型组(简称模型组)、针刺组,每组8只。

1.2主要试剂和仪器

仪器包括TX51显微镜(日本Olympus公司);H8-202显微镜(日本尼康);BC/BD-379HB卧式冰柜(青岛海尔集团);BT223S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);MDF-u50A型超低温冰箱(日本三洋公司);5810R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);针灸针(规格0.25 mm×40 mm,北京中研太和医疗器械有限公司);秒表。

试剂包括苯甲酸雌二醇注射液(宁波市三生药业有限公司,批号120207);缩宫素注射液(上海禾丰制药厂生产,批号120302);自制美兰染色溶液。

1.3寒凝证类痛经模型制备

首先用阴道涂片法筛选出处于动情间期的3月龄SD雌性大鼠,依据《药理实验方法学》[4]并加以改进,采用较公认的苯甲酸雌二醇和缩宫素联合制备法制备类痛经大鼠模型,再结合全身冷冻法制备寒凝证类痛经大鼠模型。模型组、针刺关元组采用全身冷冻法结合苯甲酸雌二醇注射法造模,每日给予大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,连续10 d,第1天及第10天日注射0.5 mg/只,第2～9天每日0.2 mg/只,末次给药后1 h后,腹腔注射缩宫素2 U/只,第1～5天每日在给药后放入﹣25℃冰柜冷冻4 h,中途在2 h打开冰柜换气5 s。盐水组每日注射同等剂量的生理盐水。降低 (P＜0.05);血浆TXB2含量无明显变化 (P＞0.05)。与模型组比较,针刺关元组血浆6-keto-PGF1a和TXB2含量均无明显变化 (P＞0.05)。详见表2。

1.4处理方法

第10天注射缩宫素模型制备成功后,针刺组给予相应的针刺处理,模型组和盐水组不做处理,观察各组大鼠的扭体反应情况20 min。

1.5针刺方法

关元穴位于大鼠两后肢根部连线的中点[5]。针刺深度4～5 mm,在刺入即刻和留针10 min时分别施平补平泻手法30 s,留针20 min,再缓慢平和地将针退出。

1.6取材及检测

1.6.1大鼠扭体反应

采用Schmauss提出的行为学评分标准[6],将扭体行为分为0～3四个等级,0级为正常姿势(手爪平放盒底或正常探查行为);1级为身体斜向一边;2级为后肢伸展,后爪背屈,躯体伸展伴频繁的盆骨侧向旋转;3级为腹部肌肉收缩,后肢后伸。记录20 min内扭体反应的潜伏期和扭体评分。扭体潜伏期为注射缩宫素后至出现扭体反应的时间(min);扭体评分=0级(次数) ×0分＋1级(次数)×1分＋2级(次数)×2分＋3级(次数)×3分。

1.6.2血浆TXB2及6-keto-PGF1a含量

大鼠在观察扭体反应后,即刻快速去冠取血,每只取3 ml置于肝素抗凝管(30mL EDTA,40mL抑肽酶)中,待血液静置30 min后用低温离心机在4℃、3500 r/min条件下离心15 min,取血浆,﹣20℃保存备测。采用ELISA方法检测血浆6-keto-PGF1a、TXB2含量,由寰宇金科生物医学技术有限公司完成。

1.7统计学方法

应用SPSS17.0软件进行统计处理。计量数据以均值±标准差表示。多组间比较采用方差分析(ANOVA),两两比较用LSD-t检验,以P＜0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1扭体反应比较

与盐水组比较,模型组扭体潜伏期明显缩短,扭体次数明显增多,扭体评分明显升高(P＜0.01);与模型组比较,针刺组扭体潜伏期明显延长,扭体次数减少,扭体评分降低(P＜0.05,P＜0.01)。结果见表1。

2.2针刺关元穴对寒凝证类痛经大鼠血浆6-keto-PGF1a、TXB2含量的影响

与盐水组比较,模型组血浆6-keto-PGF1a含量明显

表1　针刺关元穴对寒凝证类痛经大鼠扭体行为的影响

表1　针刺关元穴对寒凝证类痛经大鼠扭体行为的影响

注:与盐水组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.05,3)P＜0.01

组别　n　　潜伏期(min)　扭体次数(次)　　扭体总分(分)盐水组　8　2.63±1.19　6.13±4.39　7.13±5.94模型组　8　0.13±0.351)　25.88±4.521)　45.75±14.781)针刺组　8　1.50±1.282)　11.25±4.233)　18.25±9.713)

表2　针刺关元穴对寒凝证类痛经大鼠血浆6-keto-PGF1a、TXB2含量的影响

表2　针刺关元穴对寒凝证类痛经大鼠血浆6-keto-PGF1a、TXB2含量的影响　

注:与盐水组比较1)P＜0.05

组别　n　6-keto-PGF1a　TXB2盐水组　8　25.29±2.94　101.82±27.75模型组　8　19.28±3.071)　122.78±22.54针刺组　8　21.73±3.26　98.82±27.24

3　讨论

PGI2和TXA2均是花生四烯酸的代谢产物。PGI2是迄今活性最强的血小板聚集内源性抑制剂[7],可通过抑制血小板堆积及强烈的舒张平滑肌的扩张血管作用。TXA2主要由血小板线粒体合成和释放,有促进血小板聚集并且诱发血栓形成的作用。在生理状态下,PGI2和TXA2作用相反,二者的含量维持在正常水平从而保证血管压力以及血液循环畅通,在循环系统中发挥着重要的作用。而子宫体内含有丰富的血管,子宫血管平滑肌的舒缩功能有赖于PGI2和TXA2二者含量的稳定。

感受寒冷刺激,使血管内皮细胞分泌缩血管物质(TXA2)和舒血管物质(PGI2)含量异常,子宫血管平滑肌剧烈收缩,子宫血管痉挛,导致局部组织缺血、缺氧、炎症;血小板聚集,使血液处于高凝状态,出现寒凝证痛经中“凝”,是寒凝证痛经的主要原因之一[8]。

本实验采用苯甲酸雌二醇联合缩宫素造类痛经模型,再结合全身冷冻法,制造寒凝证类痛经模型[9-11]。雌激素可以使非妊娠大鼠子宫肌层缩宫素受体含量提高[12-13],腹腔注射缩宫素后,缩宫素与子宫肌层的缩宫素受体结合,可以引起子宫平滑肌剧烈收缩,而平滑肌收缩也符合中医学“寒性收引”的特点,最终“不通则痛”导致痛经的发生,表现为大鼠的扭体反应加强[14]以及PGI2和TXA2含量的异常。而PGI2、TXA2半衰期很短,故实验中常测定其稳定产物6-keto-PGF1a和TXB2以反映PGI2和TXA2的水平[15]。扭体反应是目前应用最广的内脏痛模型之一,长期以来一直用来检测中枢及外周的镇痛效应[16],在痛经的防治和机理研究中运用较多。

我们的研究结果显示,针刺关元穴对寒凝证类痛经大鼠疼痛反应、TXB2与6-keto-PGF1a的含量均有一定影响。针刺关元穴能较迅捷地缓解寒凝证痛经的扭体反应,缓解痛经程度。针刺关元穴镇痛效应与其改善造模后寒冷和疼痛的双重刺激使全身尤其是子宫血管内皮细胞损伤,血管舒张和收缩物质含量异常有关。针刺关元穴对寒凝证类痛经大鼠血浆TXB2与6-keto-PGF1a含量存在一定程度的良性调节作用,表现为增加6-keto-PGF1a合成,同时使血小板内TXB2合成减少,而抑制血小板聚集,恢复6-keto-PGF1a和TXB2正常含量,从而改善血管瘀滞及痉挛状态而缓解疼痛。

本研究结果表明,针刺关元穴能缓解寒凝证痛经的疼痛反应,并改善TXB2和6-keto-PGF1a的水平。针刺可能通过增加PGI2合成、抑制TXA2合成,从而抑制血小板聚集、减少血管收缩痉挛而治疗痛经,体现了针刺活血祛瘀的治疗作用。

参考文献

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【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.06.0636

文章编号:1005-0957(2016)06-0636-03

收稿日期2015-12-20

基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2012CB518506,2006CB504 503,2005CB523308);国家自然科学基金面上项目(3097379 3);教育部博士点基金项目(20090013110005)

作者简介:王洋(1989-),男,2013级硕士生

通信作者:李晓泓(1960-),女,教授,博士,博士生导师,研究方向为针灸与治未病,Email:xiaohong_li@sina.com

Effect of Acupuncture at Guanyuan(CV4)on Writhing Response and Vasomotor Substances in Rats with Dysmenorrhea Due to Coagulated Cold Syndrome

WANG Yang1,LUO Li2,LI Xiao-hong1,ZHAO Peng-fei3,4,ZHANG Qing-qing1,ZHU Shi-peng5, ZHANG Ling1,SHEN Song-xi1,QI Dan-dan1,YANG Jia-min1,SHEN Xiao-yu1,GUO Meng-wei1,ZHAO Ya-fang1,JI Bo1,REN Xiao-xuan1,ZHANG Lu-fen1,ZHU Jiang1,LI Kai-ge1,TAN Li-hua1.
1.School of Acupuncture-moxibustion and Tuina,Beijing UniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou 646000,China;3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;4.Guang’anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China;5.Second School of Clinical Medicine of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China

[Abstract]ObjectiveTo observe the analgesic effect of acupuncture at Guanyuan(CV4)and its effect on vasomotor substances in rats with dysmenorrhea due to coagulated cold syndrome.MethodThe coagulated-cold dysmenorrhea rat model was developed by Estrodiol benzoate and Oxytocin injectin plus physical freezing.The writhing response(writhing latency,writhing frequency,and writhing score)was observed,and the contents of TXB2and 6-keto-PGF1awere detected by using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultCompared with the saline water group,the writhing latency was significantly shortened,the writhing frequency was significantly increased,and the writhing score was more significantly increased in the model group(P＜0.01); compared with the model group,the writhing latency was significantly prolonged,the writhing frequency was decreased,and the writhing score was significantly lower in the acupuncture group(P＜0.05,P＜0.01).Compared with saline water group,the content of plasma 6-keto-PGF1awas significantly lower(P＜0.05)and the content of plasma TXB2showed an increasing tendency(P＞0.05) in the model group.Compared with the model group,the content of plasma 6-keto-PGF1ashowed an increasing tendency(P＞0.05) and the content of plasma TXB2showed a decreasing tendency(P＞0.05)in the acupuncture group.ConclusionThe vasomotor substances are obviously disordered in the blood of cold-coagulated dysmenorrhea rat models.Acupuncture at Guanyuan can improve the writhing response and release pain,and meanwhile positively regulate the vasomotor substances such as TXB2and 6-keto-PGF1a.The vasomotor substances are plausibly one of the major substances in the action of acupuncture in preventing and treating dysmenorrhea.

[Key words]Acupuncture;Point,Guanyuan(CV4);Coagulated cold syndrome;Dysmenorrhea;Writhing response;Vasomotor substance;Rats