徐芳 黄娜 陈燕 李晨阳 赵军 谭为

摘要：目的 建立黑种草子总皂苷滴丸的质量标准。方法 以黑种草皂苷A为对照品，采用薄层色谱法对滴丸中的黑种草子进行定性鉴别，采用比色法对滴丸中总皂苷的含量进行测定，采用高效液相色谱法对滴丸中黑种草皂苷A的含量进行测定。结果 薄层鉴别图谱斑点清晰，阴性对照无干扰；总皂苷含量测定中平均回收率为102.6%，RSD=1.96%（n=6），滴丸中总皂苷平均含量为18.13%；黑种草皂苷A含量测定中平均回收率为103.2%，RSD=1.16%（n=6），滴丸中黑种草皂苷A平均含量为14.71%。结论 本研究制定的质量标准方法准确可靠、简便易行，可用于黑种草子总皂苷滴丸的质量控制。

关键词：腺毛黑种草子；总皂苷；滴丸；质量标准

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.026

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0101-04

黑种草子为毛茛科黑种草属植物腺毛黑种草Nigella glandulifera Freyn et Sint.的干燥成熟种子[1]。黑种草子作为维吾尔族习用药材，主产于我国新疆和云南[2-4]。在维吾尔医中，黑种草子被称为“斯亚旦”，药性三级干热，味辛，具有生干生热、乌发生发、增强色素、强筋健肌、祛寒止痛等功效，主治湿寒性或黏液质性疾病[2-3，5]。本课题组前期研究结果表明，黑种草子总皂苷具有抗炎、镇痛和治疗关节炎的作用，而且安全性好[6-8]，故将其制成滴丸剂，以满足快速起效和稳定性的要求。本研究采用薄层色谱法对黑种草子总皂苷滴丸中的黑种草子进行定性鉴别，采用比色法对滴丸中总皂苷的含量进行测定，采用高效液相色谱法（HPLC）对滴丸中黑种草皂苷A的含量进行

基金项目：新疆维吾尔自治区科技计划项目（201130105-4）

测定，建立黑种草子总皂苷滴丸的质量标准，为该制剂的质量控制提供依据，并为黑种草子的进一步深入开发利用奠定基础。

1 仪器与试药

LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可见检测器（日本岛津公司）；AL204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；UV-754型紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；WHF-203B暗箱式三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；ZBS-6G智能崩解试验仪（天津市天大天发科技有限公司）；8002型电热恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）。

黑种草子总皂苷滴丸（批号20141215、20141216、20141217），新疆维吾尔自治区药物研究所植物化学研究室制备；黑种草皂苷A对照品（常春藤皂苷元3-O-β-D-吡喃木糖基-（1→3）-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）-α-L-吡喃阿拉伯糖-28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）- β-D-吡喃葡萄糖基-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，含量>95%），新疆维吾尔自治区药物研究所植物化学研究室制备；聚乙二醇4000（PEG4000），天津市盛奥化学试剂有限公司；聚乙二醇6000（PEG6000），天津市光复精细化工研究所；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状

本品为棕褐色的滴丸，味微苦。

2.2 薄层鉴别

取黑种草子总皂苷滴丸15丸，加甲醇10 mL，超声使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取黑种草皂苷A对照品，加甲醇制成每1 mL含3 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述2种溶液各5 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-水-乙酸（4∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点，紫外光下显相同颜色的荧光斑点，并且阴性对照无干扰。

2.3 检查

按照《中华人民共和国药典》滴丸剂项下要求进行重量差异、溶散时限的检查。结果黑种草子总皂苷滴丸平均每粒丸重为35 mg，3批重量差异变异系数分别为4.55%、4.78%、3.62%，均小于12%，符合药典规定。3批黑种草子总皂苷滴丸溶散时间分别为5、5、4 min，均符合药典规定（<30 min）。

2.4 总皂苷含量测定

2.4.1 对照品溶液的制备 取干燥的黑种草皂苷A对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3 mg的黑种草皂苷A对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 取黑种草子总皂苷滴丸4丸，精密称定，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.3 阴性对照溶液的制备 按处方称取基质，不加黑种草子总皂苷提取物，按滴丸制备工艺制成阴性制剂，按“2.4.2”项下方法制备，即得。

2.4.4 线性关系考察 精密吸取黑种草皂苷A对照品溶液0.1、0.16、0.22、0.28、0.34 mL，分别置于具塞试管中，用氮气吹干溶剂，精密加入8%香草醛-无水乙醇溶液0.2 mL，1 min后再加入77%硫酸溶液10 mL，摇匀，置于60 ℃水浴中恒温加热20 min，取出后立即置冰水浴中冷却5 min，同法做空白，于529 nm波长处测定吸光度，以对照品含量为横坐标，吸光度为纵坐标，得标准曲线Y=1.114 3X-0.107 5（r=0.998 4），表明黑种草皂苷A在0.3～1.02 mg范围内线性关系良好。

2.4.5 空白干扰试验 为明确滴丸中基质对总皂苷含量测定是否有影响，取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液及总皂苷提取物样品溶液，按“2.4.4”项下方法操作，于400～800 nm波长范围内扫描，结果表明供试品溶液、对照品溶液和总皂苷提取物样品溶液在529 nm波长处有最大吸收，而阴性对照溶液在400～800 nm波长范围内基本无吸光度，因此可以确定基质对滴丸中总皂苷的含量测定没有影响。

2.4.6 精密度试验 精密量取同一份供试品溶液0.2 mL 6份，按“2.4.4”项下方法操作，于529 nm处测定吸光度，结果吸光度的RSD=1.16%，表明本法精密度较好。

2.4.7 稳定性试验 精密量取供试品溶液0.2 mL，按“2.4.4”项下方法操作，分别于0、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min时在529 nm处测定吸光度，结果总皂苷平均含量为18.10%，RSD=1.07%，表明供试品溶液显色后在1 h内测定均可。

2.4.8 重复性试验 精密称取同一批样品6份，分别制成供试品溶液，分别精密量取各供试品溶液0.2 mL，按“2.4.4”项下方法操作，于529 nm处测定吸光度，结果总皂苷平均含量为18.08%，RSD=1.21%，表明本法重复性良好。

2.4.9 加样回收率试验 精密称取已知总皂苷含量的样品6份，再分别精密加入黑种草皂苷A对照品溶液适量，按“2.4.4”项下方法操作，于529 nm处测定吸光度，结果平均回收率为102.6%，RSD=1.96%（n=6），见表1。

2.5 黑种草皂苷A含量测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Agilent-Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-水（28∶72）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：210 nm；理论塔板数按黑种草皂苷A峰计算应不低于3000。

2.5.2 对照品溶液的制备 取干燥的黑种草皂苷A对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含2 mg的黑种草皂苷A对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液的制备 取黑种草子总皂苷滴丸2丸，精密称定，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.4 阴性对照溶液的制备 按处方称取基质，不加黑种草子总皂苷提取物，按滴丸制备工艺制成阴性制剂，按“2.5.3”项下方法制备，即得。

2.5.5 空白干扰试验 精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液以及总皂苷提取物样品溶液各20 ?L，在上述色谱条件下进样测定，记录色谱图（见图1）。结果黑种草皂苷A与其他成分达到基线分离，阴性对照溶液在与黑种草皂苷A相同保留时间处无色谱峰出现，因此确定基质对滴丸中黑种草皂苷A的含量测定没有影响。

2.5.6 线性关系考察 将对照品溶液分别配制成0.02、0.08、0.2、0.4、0.8、1.6、2 mg/mL的系列对照品溶液，精密吸取各对照品溶液20 ?L，在上述色谱条件下分别进样测定，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=2876416.24X+29 573.88（r=0.999 9），结果表明黑种草皂苷A在0.4～40 ?g范围内线性关系良好。

2.5.7 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，连续进样6次，结果黑种草皂苷A峰面积的RSD=0.10%，表明本法精密度良好。

2.5.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温放置，分别于1、5、8、24、32 h时进样测定，结果黑种草皂苷A平均含量为14.75%，RSD=0.39%，说明供试品溶液在32 h内测定均可。

2.5.9 日间精密度试验 在不同日期精密称取同一批样品制成供试品溶液，进样测定，结果黑种草皂苷A平均含量为14.70%，RSD=0.73%，表明本法日间精密度较好。

2.5.10 重复性试验 取同一批样品6份，分别制成供试品溶液进样测定，结果黑种草皂苷A平均含量为14.52%，RSD=1.13%，表明本法重复性良好。

2.5.11 加样回收率试验 精密称取已知黑种草皂苷A含量的样品6份，分别加入黑种草皂苷A对照品溶液适量，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液并进行测定，结果平均回收率为103.2%，RSD=1.16%，见表3。

2.5.12 样品中黑种草皂苷A含量测定 取3批样品，分别按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液并进行测定，结果见表4。

3 讨论

在薄层色谱鉴别中，通过对氯仿-甲醇-水（6∶4∶0.5）、环己烷-乙酸乙酯-丙酮（5∶5∶2）、正丁醇-水-乙酸（4∶1∶5）、正丁醇-水-乙酸（4∶1∶1）等不同展开系统进行筛选，结果显示，正丁醇-水-乙酸（4∶1∶1）为展开剂时斑点清晰，Rf值合适，并且阴性无干扰，故采用正丁醇-水-乙酸（4∶1∶1）作为展开剂。另外，供试品溶液静置后发现有沉淀，因此进行离心处理，取上清液作为供试品溶液，效果较好。

在总皂苷含量测定过程中，加入的香草醛-无水乙醇溶液需新鲜配制，否则影响吸光度测定。由于浓硫酸过于黏稠，加入后需将具塞试管密闭，震荡摇匀是关键。加热后需立即冰浴，终止反应，因此整个操作过程需要快速。

在黑种草皂苷A含量测定中，根据滴丸的溶解性，供试品溶液的制备分别考察了水和甲醇作为溶剂时的峰面积，结果表明两者峰面积很接近，考虑到样品的稳定性，故选择甲醇作为溶剂。同时，本试验还比较了直接溶解和超声处理对供试品溶液制备的影响，结果均得到澄清的溶液，经测定峰面积也很接近，由于直接溶解方法更为简单，因此采用直接溶解的方法制备供试品溶液。另外，试验中还考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸作为流动相对样品分离效果的影响，结果表明，乙腈-水（28∶72）为流动相时，样品中黑种草皂苷A色谱峰峰型、分离度良好。

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