谢瑞芳，林评兰，王瑛，周昕

上海中医药大学附属龙华医院药剂科，上海 200032

不同配伍比例当归补血汤化学成分及促血管新生作用比较

谢瑞芳，林评兰，王瑛，周昕

上海中医药大学附属龙华医院药剂科，上海 200032

目的研究不同配伍比例对当归补血汤化学成分和促血管新生作用的影响。方法采用高效液相色谱法测定不同配伍比例当归补血汤中的主要化学成分阿魏酸、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素含量；采用转基因斑马鱼模型比较不同配伍比例当归补血汤的促血管新生作用。结果随着黄芪含量的增加，不同配伍比例煎液指标成分综合得分有上升趋势，且在黄芪与当归之比为8∶2与5∶1时综合得分最高。对于斑马鱼血管损伤模型，血管恢复率排名前3位的配比分别是黄芪与当归之比为5∶1、6∶1和2∶1。结论从化学成分及促血管新生疗效综合分析，黄芪与当归经典配伍比例（5∶1）好于其他比例。

当归补血汤；化学成分；斑马鱼；促血管新生

当归补血汤为补血的代表方剂，由黄芪和当归2味药组成，用于治疗血虚发热证，亦治妇人经期、产后血虚发热头痛，或疮疡溃后、久不愈合等［1］。药理研究表明，当归补血汤具有保护心肌缺血再灌注引起的心功能减弱、促进造血、改善血液黏度等作用［2-4］，临床资料显示其对冠心病、心绞痛等心血管疾病具有很好的疗效［5-6］。历代医家对当归补血汤证的病机、主治及用药法度皆有争议。或云为气虚而设，君黄芪补气为主；或云为血虚而设，君当归补血为主；也有说为气血兼治，用于气血两虚证的治疗［7］。因此，当归补血汤中 2味中药的用药剂量在中医古籍中有许多种用法，而药物剂量的变化直接影响有效成分含量和治疗作用。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定4种指标成分含量，采用转基因斑马鱼血管损伤模型，比较不同配伍比例当归补血汤的化学成分与促血管新生的治疗作用，为临床用药提供依据。

1 仪器、试药与动物

Agilent 1290高效液相色谱仪，美国惠普公司；爱生牌斑马鱼独立养殖单元（5层双排），北京爱生科技发展有限公司；SMZ745体视显微镜，Nikon；SMZ18荧光体视显微镜，Nikon；LQ-C3003电子天平，瑞安市安特重设备；XW-80涡旋混合器，上海医科大学仪器厂；SB2200超声仪，上海医用分析仪器厂；SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；TGL-16G台式高速离心机，上海医用分析仪器厂；pH计（FE20），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

Krebs液（NaCl 119，KCl 4.7，MgCl2·6H2O 1，NaHCO325，KH2PO41.2， D-glucose 11.1，CaCl22.5）；60 mmol/L KCl Krebs液（NaCl 63，KCl 60，MgCl2· 6H2O 1，NaHCO325，KH2PO41.2，D-glucose 11.1，CaCl22.5）；溶血磷脂酰胆碱（LPC，美国Sigma公司，SLBH3673V）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma，SHBC3313V）；内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（VRI，Sigma），溶解于DMSO配制为100 mmol/L储备液，-20 ℃储存。

转基因斑马鱼 Tg（fli1a-EGFP），上海中医药大学附属龙华医院斑马鱼实验室提供，依据 zebrafish handbook方法饲养。

2 化学成分含量测定

2.1 溶液的制备

2.1.1 药液的煎煮 分别称取相应比例当归补血汤药材约100g（黄芪与当归比例为1∶5、5∶6、1∶1、2∶1、5∶2、10∶3、8∶2、5∶1、6∶1），加8倍量水，浸泡30 min，沸后加热20 min，煎煮3次，合并药液，浓缩至1g原药材/mL，得到当归补血汤及其药材水煎液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取上述水煎液 1mL置10mL容量瓶中，加甲醇接近刻度，摇匀，超声20 min，冷却至室温，补充甲醇至刻度，摇匀，静置过夜，取上清液10 000 r/min离心10 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸4.40 mg置于10mL量瓶中，毛蕊异黄酮苷5.20 mg、毛蕊异黄酮2.20 mg、芒柄花素5.20 mg，分别置于25mL量瓶中，用甲醇定容，稀释至不同浓度，用0.22 μm微孔滤膜过滤，作为对照品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Zorbax RRHD SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 µm）；检测波长：254 nm（毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花素）、316 nm（阿魏酸）；进样量：2 μL；检测时间：15 min；流动相：乙腈-0.2%磷酸水，等度洗脱（阿魏酸、毛蕊异黄酮苷，10.0%乙腈；毛蕊异黄酮、刺芒柄花素，25.0%乙腈）；流速：0.25mL/min；柱温：35 ℃。结果表明，在此条件下，各指标成分的色谱峰与杂质能够达到基线分离，峰型对称，分离较好且保留时间适中。色谱图见图1。

式中：α为中继放大转发系数，满足中继发送功率的限制；PnR是中继每根天线上发送人工噪声的平均功率；WT为中继发送信号预编码矩阵；zR是服从复高斯分布的N-K维人工噪声矢量，zR～(0,IN-K)；V2是中继人工噪声波束赋形矩阵.WT为

2.3 标准曲线的绘制

精密吸取阿魏酸、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷和芒柄花素不同浓度的对照品溶液注入色谱仪，进样量为 2 μL，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品含量为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，各指标成分在相应范围内，相关系数均＞0.999 5，线性关系良好，见表1。

2.4 指标成分含量结果

为控制所用黄芪及当归药材的质量，测量当归中的阿魏酸及黄芪中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素含量。结果表明，阿魏酸含量在复方中高于当归药材，且随黄芪在复方中所占比例上升，含量更高，可能黄芪有助于阿魏酸的溶出；毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素3个成分含量在复方中除1∶5比例者偏低，其他比例中差异不大，其中毛蕊异黄酮苷含量在复方中基本高于黄芪药材。结果见表2。

图1 当归补血汤中4种指标成分HPLC图

表1 4种指标成分线性关系考察结果

表2 不同配伍当归补血汤煎液指标成分含量（按配方比例折算，mg/g）

2.5 不同配伍比例药材含量的综合评分

为了综合评价各药材配伍比例当归补血汤有效成成分的溶出度，采用AHPP法根据当归补血汤中有效成成分HPLC检检测信息，将其316 nm波长处阿魏酸色谱谱峰及254 nmm波长处毛蕊蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、刺芒柄花素的色谱峰作为相相同权重的评分指标，计算每每种配伍的综合得分，得分越高的配伍可认为化合物成成分溶出度越高。

根据测定的HPLC含量信息，将9种配伍比例所含的每种指标标成分含量从从小到大依次排列，给予分数，再将复方方中的各成分分得分按各占 25%的权重相加，得到综合评分。指标成成分评分（%）=（成分含量-该成分含量最小值）÷÷（该成分含量最大值-该成分含量最小小值）×100%%。结果表明，黄芪与当归配伍比例为8∶2及经典配配伍比例（5∶1），综合评分较高 ，见表3。。

表3 不同配伍当归补血汤煎液指标成分评分（%）

3 促血管新生生作用研究

3.1 斑马鱼毒毒性实验

选择发育正常，受精24 h（24 hppf）的转基因因斑马鱼Tg（fli-1a：EGFP）胚胚胎，用镊子去掉卵壳，将其放入含有emmbryo mediuum的12孔板中（每孔孔10条条）。按实验分分组加入相应应浓度的药物，放入28.5℃的的培养箱中。培培养至48 hppf时，用embryo medium清洗洗12孔板中的的各个组，重新加入embryo medium和不不同浓度的药物，操作同第第1日。在培养至48 hpf和722 hpf时，观察不同浓度的的各药物组斑斑马鱼的死亡情况和致畸形情况，记录各药药物组斑马鱼鱼能耐受的最大剂剂量，为下一步实验剂量的的确定提供依据。

3.2 药物分组

分为空白对照组、VRI血管损伤模模型组、不同配伍伍比例当归补血汤给药组（1∶5，5∶1，1∶1，2∶1，5∶2，5∶6，6∶1，10∶3，8∶2）。

3.3 斑马鱼节节间血管恢复实验

在 VRI诱诱导血管损失模型中，将从背主动脉（DA）或者脊脊椎主静脉（PCV）发芽延伸并连接到背部脊索血管（DLAVs）的体节间静脉（ISVs）定义为完整血管（intact），而一些已经从DA或者PCV延伸出但并未与DLAVs相连的ISVs定义为缺陷型血管（defective）。

选择发育正常，24 hpf的转基因斑马鱼Tg（fli-1a：EGFP）胚胎，用镊子去掉卵壳，将其放入含有embryo medium的12孔板中（每孔10个）。模型组和给药组先加入VRI 100 nmol/L在28.5 ℃培养箱中处理3 h，然后加embryo medium清洗3遍，模型组加入embryo medium，药物组则加入相应的药物，放入28.5 ℃饲养箱里，培养至48 hpf时，在荧光显微镜下拍照，观察不同药物对斑马鱼节间血管的影响。分别对每条斑马鱼的完整血管和缺陷型血管进行统计，研究药物对斑马鱼节间血管的恢复作用。

统计每组加药浓度的节间血管指数（完整血管数+0.5×缺陷型血管数），根据血管指数计算VRI诱导斑马鱼血管损伤模型给药后的血管恢复率［（该组血管指数-VRI组血管指数）÷（空白对照组血管指数-VRI组血管指数）×100%］，每组实验至少重复3次。

3.4 统计学方法

3.5 结果

3.5.1 正常斑马鱼毒性实验结果 以当归和黄芪1∶5比例组成的当归补血汤，进行斑马鱼药物毒性筛选，观察斑马鱼给药24、48 h后致死情况，从而得到药物最大安全浓度，为进一步研究提供剂量依据。结果表明，当归补血汤最大安全浓度为250 μg/mL。

3.5.2 不同配比的当归补血汤对血管损伤斑马鱼模型的保护作用 将不同配伍比例的当归补血汤煎液均稀释至浓度为200 μg/mL，并以该浓度给药48 h，比较各比例当归补血汤对 VRI诱导的损伤斑马鱼节间血管的作用。各组斑马鱼血管生成图见图2、血管数量见图3。结果表明：①各配伍比例当归补血汤加药组中，在处理48 h后均有明显的对VRI诱导血管损伤斑马鱼的保护效果，与模型组比较有明显差异，说明各配伍比例的当归补血汤对 VRI损伤的斑马鱼节间血管均有促血管新生作用。②各配伍比例当归补血汤加药组中，每组对VRI诱导血管损伤斑马鱼修复效果不同。对3次实验各组血管恢复率均值进行排序，结果血管恢复率排名前3位的配伍比例分别是黄芪与当归比例为5∶1、6∶1和2∶1。

图2 各组斑马鱼节间血管生成图

图3 各配伍当归补血汤对VRI损伤斑马鱼节间血管数量的影响（n=10）

表4 不同配伍比例当归补血汤血管恢复率比较（n=10）

4 讨论

中医学经典理论虽未直接提出血管新生的概念，但有许多相关认识。血管概念包括在“脉”“血脉”“血络”含义中，其中“脉”包含解刨学较大“血管”，而“血络”则特指微血管，为“脉”细小分支与延续。脉络生成与功能和五脏均有联系，其“资始于肾”，“资生于胃”，“统于心”，“会于肺”，“约于肝”［8］。从补肾益精、补益心气、调肝理气、活血化瘀、养血生脉的角度，探索中药的促血管生成作用，是一个较为有意义的研究方向。

斑马鱼是目前生命科学研究中中药的模式脊椎动物之一，作为一种新的模式生物［9］，既有与哺乳动物类似的生理、生化特征，又具有高效、快速、大规模的特点。近年来，转基因斑马鱼已成为血管新生研究的重要模型之一，可观测斑马鱼的血管系统内皮细胞上有绿色荧光蛋白的表达，直接观察药物对血管的效应。斑马鱼的血管发生为：大的轴向血管（背动脉和尾部静脉）和尾部静脉簇的发生方式是血管形成，其他血管的发生方式是血管新生［10-11］。斑马鱼血管发生过程很快，受精后不久，胚胎心脏开始有规律的跳动，背动脉和尾部静脉内出现血细胞流动，体节间血管开始向背部生长。用VRI抑制血管新生造成血管损伤模型，不仅靶点清晰，而且针对性强［12］。因此，本研究采用 VRI抑制斑马鱼血管生成模型研究不同配伍比例对血管新生的影响。结果表明，复方疗效好于单味，且血管恢复率排名前3位的配比分别是黄芪与当归为5∶1、6∶1和2∶1。

此外，本研究比较了不同配伍比例的当归补血汤的化学成分，结果表明，随着黄芪含量的增加，不同配比煎液指标成分综合得分有着上升趋势，并在黄芪当归之比8∶2、5∶1时综合得分最高。

由此可见，当归补血汤经典配伍比例（黄芪∶当归=5∶1）无论是有效成分的含量还是促血管新生的疗效，都比其他配伍比例好。本研究为当归补血汤的配伍理论提供了一定的依据。

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Comparative Study on Chem ical Ingredients and Angiogenesis Effects for Different Compatibility Proportions of Danggui Buxue Decoction

XIE Rui-fang， LIN Ping-lan， WANG Ying，ZHOU Xin
（Department of Pharmacy， Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200032， China）

ObjectiveTo study chemical ingredients and angiogenesis effects for different compatibility proportions ofDanggui BuxueDecoction.MethodsFor chem ical components， HPLC was performed to study the ingredients （Ferulic Acid， Calycosin-7-glusosido， Calycosin， Formononetin） inDanggui BuxueDecoction. For angiogenesis effects， transgenosis zebrafish model was incubated with different proportions ofDanggui BuxueDecoction.ResultsWith the raise of Astragali Radix content， the synthetic scores of four ingredients in different compatibility proportions increased. When the Astragali Radix content to Angelicae Sinensis Radix content was 8 to 2 and 5 to 1， the scores were the highest. For zebrafish vascular injury model， vessel recoveries in top three were 5∶1，6∶1 and 2∶1 （Astragali Radix∶ Angelicae Sinensis Radix）.ConclusionFrom comprehensive analysis of chem ical composition and angiogenesis， the best compatibility ratio of Astragali Radix to Angelicae Sinensis Radix is 5∶1.

Danggui BuxueDecoction； chemical components； zebrafish； angiogenesis

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.022

R284.1

A

1005-5304（2016）06-0083-05

2015-07-10）

（

2015-07-29；编辑：陈静）

上海中医药大学预算内科研项目（2013JW36）；“龙医团队，龙医学者”项目（LYTD-14）

周昕，E-mai l：2479707904@qq.com