朱贝贝，刘萍萍，李淑玲，刘凯，，李应东，

1.甘肃中医药大学中西医结合研究所，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院省级重点实验室，甘肃 兰州 730000

当归红芪超滤膜提取物对过氧化氢致PC12细胞凋亡的影响

朱贝贝1，刘萍萍2，李淑玲1，刘凯1，2，李应东1，2

1.甘肃中医药大学中西医结合研究所，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院省级重点实验室，甘肃 兰州 730000

目的观察当归红芪超滤膜提取物对过氧化氢（H2O2）致PC12细胞凋亡的影响，探讨其作用机制。方法H2O2诱导PC12细胞凋亡，构建氧化损伤神经细胞凋亡模型。实验分为正常对照组、模型组及中药低、中、高剂量组，中药各组给予不同剂量当归红芪超滤膜提取物。流式细胞术检测细胞凋亡率，激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位变化，Western blot检测Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表达。结果与模型组比较，中药各剂量组细胞凋亡率明显降低，线粒体膜电位升高，Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达均减弱，Bcl-2表达增强，Bcl-2/Bax比值升高（P＜0.05）。结论当归红芪超滤膜提取物具有抗H2O2诱导的PC12细胞凋亡的作用。

当归红芪超滤膜提取物；过氧化氢；PC12细胞；凋亡

当归红芪超滤膜提取物（ultra-filtration extract from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix，UFE-AH）具有抗自由基、抗氧化损伤等功效［1-4］。过氧化氢（H2O2）是活性氧族（ROS）的主要成分之一，能够损伤生物膜和线粒体，是建立细胞氧化应激损伤模型、诱导细胞凋亡一种比较常用的诱导剂。本研究以PC12细胞株为研究对象，采用H2O2诱导PC12细胞凋亡，不同浓度UFE-AH进行干预，通过检测细胞凋亡率和线粒体跨膜电位及 Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达，观察UFE-AH对H2O2致PC12细胞凋亡的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞株和药物

PC12细胞，中国科学院上海细胞库。PC12细胞常规培养，完全培养基（DMEM培养基，10%胎牛血清，青霉素 100 U/mL，链霉素 100 mg/mL），置于37 ℃、5%CO2培养箱中，每隔36 h换液，细胞贴壁生长至 80%密度时，0.25%胰蛋白酶消化传代。UFE-AH，甘肃中医药大学科研实验中心和甘肃省膜科学研究院联合制备，药物成分为多糖39.9%、皂苷3.5%、其他56.6%，高效液相检测指纹图谱进行质控：样品用50%甲醇溶解，微波助溶，Inertsil ODS-SP G8色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），检测波长275 nm，甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～20 min，3∶97；20～40 min，20∶80；40～50 min，60∶40；50～60 min，90∶10）［5-6］。

1.2 试剂

30%H2O2溶液，天津富宇试剂有限公司；胎牛血清、DMEM高糖培养基，赛默飞世尔生物化学制品有限公司；链霉素、青霉素，华北制药股份有限公司；磷酸缓冲液配制粉，北京中杉金桥生物技术有限公司；1∶250胰蛋白酶，GIBCO公司；AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，德国Miltenyi生物有限公司；二甲基亚砜、MTT试剂、罗丹明123染液、兔抗 Bax多克隆抗体、兔抗 Bcl-2多克隆抗体、兔抗Caspase-3多克隆抗体，美国Sigma公司；辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG，武汉博士德生物工程有限公司；PVDP膜，加拿大BBI公司。

1.3 仪器

BB16UVCO2培养箱（德国 Heraeus公司），Infinite200 PRO序列多功能酶标仪（Tecan奥地利有限责任公司），PowerPac Universal型电泳仪、Mini Protean 3 Cell小型电泳槽、小型Trans-Blot转印槽（美国Bio-Rad公司）；AIPhalmager 2200型凝胶成像分析系统（美国AIPha公司），DYCP3lD型电泳槽、DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂），XL型流式细胞仪（美国Coulter公司），FV1000激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）。

2 实验方法

2.1 过氧化氢诱导 PC12细胞凋亡剂量及作用时间选择

选取对数生长期PC12细胞，接种于96孔板中，完全培养基中加入0、50、100、200、300、400 μmol/L H2O2，置于细胞培养箱中培养3、6、12、24 h，MTT法检测各组细胞活力，确定本实验 H2O2诱导 PC12细胞凋亡的时间及浓度。

2.2 当归红芪超滤膜提取物剂量选择

取对数生长期的PC12细胞，接种于96孔板中，完全培养基中加入0、0.19、0.38、0.75、1.5、3.0g/L UFE-AH，置于细胞培养箱中培养24 h，MTT法检测各组细胞活力，确定本实验UFE-AH的剂量。

2.3 分组、造模及给药

H2O2诱导PC12细胞凋亡，构建氧化损伤神经细胞凋亡模型。实验分为正常对照组（正常培养 PC12细胞）、模型组（培养基中加200 μmol/L H2O2）和中药低、中、高低剂量组。中药低、中、高低剂量组分别加入0.38、0.75、1.50g/L的UFE-AH，培养6 h。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡

吸弃旧培养基，加PBS 2mL冲洗后吸弃；消化收集细胞悬液至EP管，1000 r/min离心5 min；吸弃上清液，加生理盐水1mL吹匀成细胞悬液；1000 r/min离心5 min后加缓冲液；加AnnexinV-FITC 5 μL，避光孵育10 min，加碘化丙啶10 μL避光染色5 min，流式细胞仪进行检测。

2.5 激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位

取生长状态良好的对数生长期PC12细胞，将其接种于共聚焦专用培养皿中，小心吸弃旧培养基，PBS冲洗3次，吸弃；每孔加入配制好的RH123染料10 μL（终浓度为10 mg/L），避光染色15 min；PBS冲洗3次，吸弃；镜下观察细胞内荧光强度，激发波长488～505 nm，发射波长530 nm，每组选6个样本，每个样本随机取3个视野观测拍照，应用Image Pro-Plus 6.0软件分析细胞内荧光积分光密度（IOD）值/荧光区域面积（Area）。

2.6 Western blot检测 Bcl-2、Bax和 cleaved Caspase-3蛋白表达

预冷PBS洗涤细胞，加蛋白裂解液提取细胞蛋白质（需在冰上进行操作）；用考马斯亮蓝测定蛋白浓度，决定上样量；取样品适量至EP管，加上样缓冲液混匀，沸水中煮10 min使蛋白变性；根据蛋白测定浓度，每孔加样 20 μL，加 Marker作为对照，经SDS-PAGE电泳并转PVDF膜；脱脂奶粉（5%）封闭1 h后，加TBST置摇床漂洗4次，每次5 min；分别加10 μL Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3抗体，37 ℃孵育20 min，4 ℃冰箱过夜；次日37 ℃孵育20 min，加TBST漂洗4次，每次5 min；以β-actin作内标，加2 μL辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37 ℃孵育60 min；加TBST漂洗4次，每次5 min；加ECL发光试剂孵育，在暗室将膜在感光胶片上曝光、显像，扫描进行灰度分析，实验重复4次。用Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3与β-actin灰度比值表示细胞内相关蛋白的含量。

3 统计学方法

采用SPSSS19.0统计软件进行分析。实验数据以

4 结果

4.1 过氧化氢诱导PC12细胞凋亡模型结果

与0 μmol//L H2O2组比较，50、1000、200、3000、4000 μmol/L H2OO2组细胞活力下降，且细胞活力下降与H2O2的浓度呈一定相关性，200 μmol/LL H2O2PC12细胞活力下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；与0 μmol/L H2O2组比较，H2OO2作用6 h时细胞活力下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。故确定 H22O2浓度为200 μmmol/L作用时间6 h构建PPC12细胞凋亡模型。

4.2 当归红芪超滤膜提取物对PC12细胞增殖的影响

与0g/L UUFE-AH比较，0.19、0.338、0.75、1.5、3.00g/L UFE-AAH对PC122细胞增殖有促进作用，在0.338～1.50g/L及作用时间224 h内存在一定量效和时效关系，0.38g/LUFE-AH作用PC12细胞18 h、0.75 gg/L UFFE-AH作用PPC12细胞12 h、1.5g/LL UFE-AH作用PCC12细胞6 h均有明显的促增殖效应，差异有统计学意义（P＜0.055）。

4.3 当归红芪超滤膜提取物对过氧化氢损伤PC1122细胞凋亡的影响

与正常对照组比较，模型组早期凋亡细胞（D4象限细胞）百分率明显上升（P＜0.05），正常细胞（D3象限细胞）百分率明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，中药中、高剂量组正常细胞（D3象限细胞）百分率明显上升，早期凋亡细胞（D4象限细胞）百分率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.055）。结果见表1、图1。

表1 各组细胞凋亡率比较（±s，%）

表1 各组细胞凋亡率比较（±s，%）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.05（下同）

别 n 剂量/（g/L） 正组常细胞 早期凋亡细胞照组 4正常对94.03±3.623.11±2.03模型组中药低剂中药中剂中药高剂4量组 4量组 4量组 4 81. 0.38 85. 0.75 87. 1.50 89. 51±4.51#12±3.77 51±3.98*37±4.12*11.91±2.41#10.37±2.26 7.91±1.92*6.72±2.01*

图1 各组细胞凋亡流式细胞图

4.4 当归红芪超滤膜提取物对过氧化氢损伤PC1122细胞线粒体膜电位的影响

与正常对照组比较，模型组PC122细胞内荧光强度、细胞线粒体膜电位明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组PCC12细胞内荧光强度、细胞线粒体膜电位明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2、图2。

表2 各组细胞线粒体膜电位水平比较（±s）

表2 各组细胞线粒体膜电位水平比较（±s）

别 n 剂量/（g/L）组IODD/Area正常对照组 1839.455±5.21模型组中药低剂中药中剂中药高剂18量组 18量组 18量组 18 0.38 0.75 1.50 10.35 14.87 22.54 32.17 ±3.45#±4.61*±4.27*±5.46*

图2 各组细胞线粒体膜电位荧光图（×4000）

4.5 当归红芪超滤膜提取物对过氧化氢损伤PC1122细胞Bcl-2、Bax和cleaved CCaspase-3蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组PC122细胞中Baxx、cleeaved Caspasee-3蛋白表达量明显增加，Bcl-2蛋白表达量明显下降，Bcl-2/Bax比值降低，差异有统计学意义（P＜0.055）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组PC12细胞BBax、cleavedCaspase-3蛋白表达量显著降低，Bcl-2蛋白表达量显著增加，Bcll-2/Bax比值显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表3、图3。

表3 各组细胞Bcl-2、Bax及cleaved Cas pase-3蛋白表达比较（±s）

表3 各组细胞Bcl-2、Bax及cleaved Cas pase-3蛋白表达比较（±s）

组别n 剂剂量/（g/L）cleaved Caspa se-3正常对照组Bax Bcl-2Bcl-2/Bax 4 0.19±0.031.01±0.103.99±0.163.95±0.13模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组4 4 4 4 4# 0.38 0.75 1.50 0.42±0.04 0.30±0.05 0.25±0.05 0.21±0.04 * 5* 4* 1.92±0.15#1.89±0.16*1.67±0.15*1.59±0.14*2.01±0 2.84±0 2.72±0 3.91±0 .14#.16*.15*.15*1.05±0.14#1.50±0.16*1.63±0.15*2.46±0.15*

图3 各组细胞Bcl-2、Bax和cl eaved Caspase-3蛋白表达免疫印迹电泳图

5 讨论

生理状状态下，机体的的氧化水平与抗氧化水平保持着动态平衡，对机体不构成伤害。然而，当机体处于特定的环境境因素、压力或或者疾病状态下，这种平衡被破坏，机体内氧化和抗氧化水平失衡，导致大量ROS在细胞中堆堆积，不能被及时清除，会造成组织器器官的损伤，从而引起疾病的发发生，称氧化化应激。H2OO2是强氧化剂，属于外源性的ROS，当将其作为一种膜通透性的ROS被加入细胞培培养体系后，，可直接破坏细胞或线粒体膜性结构，从而引起细胞的的凋亡。线粒体在调节凋亡的的过程中起着关键作用。细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都都与线粒体密切相关，包括Caspases激激活因子的释放放，如细胞色素C、电子传递链的改变，线粒体膜电位位的丧失，细胞内氧化还还原状的改变，Bccl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等［7］。Caspase-3是是细胞凋亡的的重要组成部部分，是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶，正常情况下，Caspase-3以无活性的的蛋白酶原原形式存在在（即pro-Caspasee 3），当受到信号刺激后，酶解为活性酶碎片（即cleaaved Caspase3），cleavedd Caspase 3的的表达量可以反映出细胞的凋亡水平，而Bcl-2蛋白属于抗凋亡蛋白，可通过调控谷胱甘肽等的的水平调控核核内氧化还原平衡以达到控制Caspase的活性抑制凋亡的作用［8-10］。在线粒体凋亡通通路中，Bcl-2家族的抗凋凋亡与促凋亡蛋白通过形成异异源二聚体并定位于线粒体外膜上发挥作作用，对维持线粒体膜的完完整性、维持持正常的线粒体跨跨膜电位、抑制制线粒体膜间间隙蛋白细胞色素C的释放有重要要意义，Bcl--2/Bax比值降低细胞趋向凋亡，Bcl-2/Baxx比值升高细胞趋向存活［11］。本研究应用200 μmol/LH2O2作用PPC12细胞6 h成功构建氧化损伤神经细胞凋亡模型，研究结果显示，H2O2作用PC C12细胞6 h可明显造成细胞线粒体膜电位的异常，诱诱导Bax、cleeaved Caspase-3高表达，进而引发凋亡的的发生。应用UFE-AH干预H2O2诱导的PC12细胞凋亡结果显示，UFE-AH通过改善H2O2损伤的PC12细胞线粒体膜电位异常，降低Bax、cleeaved Caspase-3的的表达，升高Bcl-2的表达，抑制H2OO2诱导的PC12细胞凋亡。

针对神经细胞的损伤，，中医多从补补肾入手，依据填精益髓的理论展开研究，本研究依据精血同源理论，从气血论治神经细胞损损伤修复，选方依据益气养血名方当归补血汤。红芪为为豆科植物多多序岩黄芪的的干燥根，与黄芪功功效相当。现现代药理研究显示，其具具有良良好的抗自由基、抗氧化、、抗肿瘤及提提高免疫力等等作用［12］。当归乃临床最常用的的补益药之一，现代药理研究表明，其具有抗氧化、抗抗衰老、抗肿瘤、抗辐射射、提高免疫力等功效［13］。UFE-AH是当归、红芪按1∶5比比例混合，利用膜超滤技术，有效去除除药物中杂质质，保保留药物有效成分，研究显示具有抗自自由基、抗氧化损伤、抗衰老、抗辐射、促进血管新生生等功效［14-17］。当归为血中气药，具有活血补血之功，红芪有益气升阳之力，二药合用补气生血之力强，气血旺则精生，精生则髓长。线粒体是细胞产生能量的的场所，中医气血理论与其密切相关。本研研究结果显示示，当UFE-AH对对神经细胞线粒体功能有有积极调控作作用，可以对抗H22O2对PC12细胞线粒体膜结构与功能能的破坏，防治其诱导的细胞凋亡。本研究结果提示益益气养血中药有助助于氧化应激损伤神经细胞的康复。

［1］ 李应东，赵信科，，刘凯.当归红芪超超滤物对急性心肌肌梗死大鼠 SOD、MMDA、LDH1及HSP70的影响［J］.中华中医药杂志，2011，26（10）：2430-2433.

［2］ LI Y D， MA Y H， ZHAO J X， et al. Protection of ul t ra-f il t ration extract f rom Danggui Buxue Decoction in cardiomyocytes of neonatal rats and its mechanism［J］. ChinJ Integr Med，20011，17（11）：854-859.

［3］ 马燕花，李应东，赵健雄，等.当归红芪超滤物对氧化损伤乳鼠心肌细胞的保护作用及其机制［J］.中草药，2010，41（4）：602-607.

［4］ 李应东，赵信科，李子佳，等.当归红芪超滤物对急性心肌梗死大鼠的保护作用及对热休克蛋白 70表达的影响［J］.第三军医大学学报，2011，33（1）：92-94.

［5］ 樊秦，李应东，舒畅，等.超滤膜分离纯化当归补血汤的研究［J］.中成药，2010，32（8）：1438-1440.

［6］ 顾丽娟，刘凯，孙少伯，等.当归红芪超滤物对过氧化氢致内皮细胞凋亡中热休克蛋白 70及内皮型一氧化氮合酶表达的影响［J］.中国中医药信息杂志，2015，22（4）：51-54.

［7］ 陈鄑先，许彩明，潘华珍.线粒体与细胞凋亡［J］.解剖学报，2000，31（3）：285-287.

［8］ ROMANO G， BRIGUORI C， QUINTAVALLE C， et al. Contrast agents and renal cel l apoptosis［J］. Eur Heart J，2008，29（20）：2569-2576.

［9］ PARRISH A B， FREEL C D， KORNBLUTH S. Cel lular mechanisms cont rol ling caspase activation and function［J］. Cold Spring Harb Perspect Biol，2013，5：a008672.

［10］ SATO T， MACHIDA T， TAKAHASHI S， et al. Fas-mediatedapoptosome formation is dependent on reactive oxygen species derived f rom mitochondrial permeabil ity transition in Jurkat cel ls［J］. J Immunol，2004，173（1）：285-296.

［11］ HOWELLS C C， BAUMANN W T， SAMUELS D C. The Bcl-2-associated death promoter （BAD） lowers the threshold at which the Bcl-2-interacting domain death agonist （BID） t riggers mitochondria disintegration［J］. J Biol Chem，2011，271（1）：114-123.

［12］ 杨林，谭玉玲.中药红芪研究现状［J］.中外医疗，2010，15（5）：120-121.［13］ 李曦，张丽宏，王晓晓，等.当归化学成分及药理作用研究进展［J］.中药材，2013，36（6）：1023-1028.

［14］ 李应东，王博雯，周倩倩，等.当归红芪超滤物对自然衰老大鼠抗氧化作用机制的研究［J］.时珍国医国药，2012，23（6）：1439-1441.

［15］ 刘野，李应东.当归红芪超滤膜提取物含药血清对辐射心肌成纤维细胞SOD和羟脯氨酸的影响［J］.甘肃中医学院学报，2010，27（3）：1-3.

［16］ 刘凯.当归红芪合剂超滤膜提取物 ECV-304细胞血管内皮生长因子mRNA表达的影响［J］.中国中医药信息杂志，2010，17（3）：36-38.

［17］ 安耀荣，李应东，刘凯.当归红芪合剂超滤膜提取物对ECV-304细胞增殖周期的影响［J］.中成药，2009，31（6）：937-940.

Effects of Ultra-filtration Extract from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix on PC12 Cell Apoptosis Induced by H2O2

ZHU Bei-bei1， LIU Ping-ping2， LI Shu-ling1， LIU Kai1，2， LI Ying-dong1，2
（1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Provincial Level Key Lab， Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Ob jectiveTo observe the effects of ultrafiltration extract from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix on PC12 cell apoptosis induced by H2O2； To discuss its mechanism of action.MethodsH2O2was used in the incubation of PC12 cells to establish the oxidative damage nerve cell apoptosis model. The experiment was divided into normal control group， model group， and three different dosages （0.375， 0.75， 1.5g/L） of ultra-filtration extracted from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix after modeling for interference. Rate of cell apoptosis was detected by flow cytometry； mitochondrial membrane potential was measured by laser scanning confocal microscopy； the protein expressions of cleaved Caspase-3， Bax and Bcl-2 were detected by Western blot.ResultsCompared with the model group， rates of cell apoptosis in the different dosage groups decreased significantly； membrane potential of mitochondria increased； the protein expressions of cleaved Caspase-3 and Bax decreased； the expression of Bcl-2 increased； the ratio of Bcl-2 and Bax increased （P＜0.05）.ConclusionThe ultra-filtration extracted from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix can inhibit PC12 cell apoptosis induced by H2O2.

ultra-filtration extract from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix； H2O2； PC12 cells； apoptosis

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.018

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0068-05

2015-09-02）

（

2015-10-12；编辑：华强）

国家自然科学基金（81160478）；甘肃省高等院校研究生导师科研项目（BH2011-043）

李应东，E-mai l：lydj412@163.com