梁静，张渊2，曹灵3，孟祥龙，王莉2*

（1.四川省医学科学院·四川省人民医院城东病区肾脏科，成都 610110；2.四川省医学科学院·四川省人民医院肾脏科，成都 610072；3.泸州医学院附属医院肾病内科，四川泸州 646000）



纤溶系统对膜性肾病大鼠足细胞损伤的影响

梁静1，张渊2，曹灵3，孟祥龙1，王莉2*

（1.四川省医学科学院·四川省人民医院城东病区肾脏科，成都 610110；2.四川省医学科学院·四川省人民医院肾脏科，成都 610072；3.泸州医学院附属医院肾病内科，四川泸州 646000）

【摘要】目的 探讨早期预防纤溶紊乱对防止MN进展有重要意义。方法 按改良Border法制作MN大鼠模型，正式免疫第1、2、3、4周末检测全血uPA、tPA及PAI-1的表达水平；取大鼠肾组织进行光镜、电镜观察肾组织病理学改变；采用免疫组化方法检测肾足细胞nephrin、WTl蛋白表达含量，并进行相关性分析。结果 与正常组及干预组大鼠相比，模型组大鼠的全血uPA、tPA水平明显减少，而PAI-1水平明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；电镜显示肾小球足细胞广泛足突融合至消失；GBM基质出现“钉样突起”，肾间质纤维化程度较重。肾小球足细胞分布区WT-1和nephrin蛋白表达下调，其中nephrin蛋白表达量变化有统计学意义（P＜0.01）。相关性分析显示，大鼠全血tPA和uPA水平与肾组织nephrin蛋白的表达变化呈正相关，全血PAI-1水平与肾组织nephrin蛋白的表达变化呈现负相关。结论 在MN发展中，纤溶系统对足细胞损伤凋亡具有重要意义，早期评估预测MN足细胞损伤情况或可为防治早期MN步入终末期肾脏病找到又一治疗靶点，亦可为临床研究治疗MN的药物提供新的思路。

【关键词】膜性肾病；足细胞；Nephrin；WT-1；纤溶系统

膜性肾病（membranous nephropathy，MN）是一种非炎症性肾小球疾病，表现为肾小球细胞外基质合成与降解失衡而导致的肾小球基底膜普遍增厚及肾小球硬化。纤溶系统在膜性肾病的发生发展中发挥重要的作用［1］。作为纤溶系统中重要的活性物质，血浆中组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）及其抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）之间的动态平衡，尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）等物质对维持微血管的正常生理功能起重要作用［2］。本研究通过构建大鼠膜性肾病模型，对膜性肾病血清uPA、tPA、PAI-1的变化情况及其对足细胞损伤凋亡的影响及肾脏病理的影响进行了探讨，旨在为临床预测MN足细胞损伤及预后提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂

兔抗大鼠nephrin抗体、兔抗大鼠WT1多克隆抗体均购自Santa Cruz公司；阳离子化牛血清蛋白（C-BSA）购自Chondrex公司；低分子肝素速碧林购自杭州寒诺菲圣德拉堡民生制药有限公司；大鼠uPA ELISA试剂盒购自Elabscience公司；大鼠tPA ELISA试剂盒购自 Elabscience公司；大鼠 PAI-1 ELISA试剂盒购自Elabscience公司。

1.1.2 动物及分组

由四川省人民医院实验动物研究所提供雄性、清洁级SD大鼠30只，体重为（200±20）g，动物适应环境7 d，将尿蛋白为阴性者随机分为正常组和模型组，正常组10只；模型组10只；干预组10只。

1.2 方法

1.2.1 C-BSA肾炎模型制作

采用改良版Border法［3］，取C-BSA 1mL溶解于0.5 mL生理盐水中，与等量不完全弗氏佐剂充分乳化，在大鼠颈背部，腹股沟等皮下多点注射，1周后通过连续4周隔日尾静脉注射C-BSA（16 mg/kg）制作大鼠膜性肾病模型作为模型组，正常组隔日尾静脉注射1 mL生理盐水（NS）代替C-BSA。干预组参照说明书及相关文献［3］每日分两次皮下注射给予低分子肝素治疗，确定剂量为450 U/kg。模型组及正常对照组每日两次皮下注射给予同等剂量的生理盐水。

1.2.2 标本收集

各组大鼠于实验第1、2、3、4周末各取4只用颈动脉托管法取血各6 mL后4℃离心分离血清，-20℃冰箱保存以供测定血清uPa、tPa、PAI-1；第4周末对各组大鼠杀检，肾脏取下后剥离肾包膜，取一部分肾组织迅速置于液氮，之后转入-80℃保存；其余肾组织用4%多聚甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡制成3 μm切片备用。

1.2.3 肾脏组织病理形态学

取部分肾脏石蜡切片，分别进行PASM染色、Masson染色［4］，高倍光镜及电镜下观察大鼠肾组织的病理形态学变化。

1.2.4 肾脏组织病理学图像分析

使用Meta Morph图像分析系统在400倍光镜下随机选取10个视野测定每组PASM染色切片的肾小球系膜阳性目标吸光度（A）。使用 HMIAS-2000高清晰彩色病理图文报告分析系统在400倍光镜下选取10个皮质视野进行拍照，取平均值计算纤维化面积占整个视野间质面积（肾小球、肾小管及血管面积不计算在内）的比值。

1.2.5 免疫组织化学检查

采用SP法，石蜡包埋的切片常规脱蜡至水，抗原热修复，体积分数为3%的H2O2阻断清除内源性过氧化物酶；正常山羊血清封闭液30℃恒温封闭30 min，分别用抗体效价为1∶100 μL的兔抗大鼠nephrin、WT1多克隆抗体，4℃孵育过夜，滴加生物素标记的抗兔抗体（原液），30℃孵育40 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（原液），30℃孵育40 min；最后加DAB显色，显微镜下控制显色反应，苏木素复染，中性树胶封片。以肾实质细胞胞质内棕褐色颗粒为阳性，采用GD-8病理彩色图像分析处理系统进行分析。

1.2.6 ELISA

血清uPa、tPa、PAI-1的检测严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.3 数据统计

全部数据采用SPSS 17.0 for Windows软件包统计分析，结果用均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。相关性分析采用线性分析法。

2 结果

2.1 一般指标变化

与正常组相比，模型组血清uPa和tPa水平明显下降，PAI-1显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组间比较，模型组血清uPa从第1周开始显著低于正常组，血清tPa水平从第2周开始显著低于正常组，血清PAI-1从第2周开始显著高于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。肝素干预组一般指标与正常组相似，从第二周开始，模型组较干预组各指标差异有显著性（P＜0.05）。见表1。

2.2 模型组大鼠肾组织病理形态学观察

光镜下可见正常组肾组织病理学检测未见异常；干预组大鼠肾组织病理学检测亦未见明显异常；模型组HE染色可见肾小球明显肿大，部分肾小管上皮细胞肿胀，肾间质纤维化程度严重；Masson染色结果显示嗜复红蛋白有明显沉积；PASM染色显示GBM、TBM显示弥漫性增厚，出现“梯状”外观。电镜观察显示正常组肾组织超微结构正常；模型组肾组织出现明显病理损害，肾小球上皮下可见电子致密物沉积，“钉突”明显可见，肾小球足细胞广泛足突融合甚至消失。见图1、2。

表1 各组大鼠血清uPa、tPa、PAI-1水平的比较（±s，ng/mL）Tab.1 Comparison of serum levels of uPa，tPa，and PAI-1 in the rats

表1 各组大鼠血清uPa、tPa、PAI-1水平的比较（±s，ng/mL）Tab.1 Comparison of serum levels of uPa，tPa，and PAI-1 in the rats

注：*与正常组相比，P＜0.05；#与干预组相比，P＜0.05。Note.Compared with the normal group，*P＜0.05；Compared with the intervention group，#P＜0.05.

指标Indexes干预组Intervention group uPa　1　1.13±0.06　0.86±0.04*　1.05±0.03 2 1.14±0.08　0.71±0.03*#　1.06±0.04 3 1.07±0.02　0.62±0.01*#　1.01±0.06 4 1.03±0.05　0.55±0.01*#　0.92±0.12 tPa　1　2.87±0.12　2.58±0.09　2.83±0.21 2 2.67±0.11　2.36±0.04*#　2.62±0.09 3 2.91±0.07　1.92±0.07*#　2.81±0.13 4 2.83±0.16　1.70±0.08*#　2.61±0.06 PAI-1　1　21.85±2.14　22.69±1.53　21.87±3.13 2 20.64±1.46　23.24±1.08*#　20.94±1.47 3 20.69±1.38　26.51±1.14*#　21.74±1.95 4 22.47±0.42　29.62±1.95*#　22.83±0.85 周Weeks正常组Normal group模型组Model group

2.3 大鼠肾间质纤维化面积

模型组肾组织的纤维化面积为（28.21± 11.53）%，正常组为（12.63±5.42）%，干预组为（13.12±3.51）%；与正常组相比，模型组面积更大，差异有显著性（P＜0.01）。相关性分析显示，大鼠全血tPA和uPA水平与肾间质纤维化面积呈现负相关（r=-0.8654，P＜0.05；r=-0.8243，P ＜0.05），全血PAI-1水平与肾间质纤维化面积呈现正相关（r=0.8324，P＜0.05）。

图1 大鼠肾组织病理形态学变化×400；HE染色Fig.1 Pathological changes in the rat kidney tissues HE staining×400

注：从左到右依次为Masson染色（×400）、PASM染色（×400）、电镜（×20 000）。图2肾组织病理形态学观察Note.Pathological changes of the rat kidneys.Masson staining，×400；PASM staining，×400；Electron microscopy，×20 000.Fig.2 Pathological observation of the kidney tissues

2.4 肾组织WT1蛋白和nephrin蛋白的表达变化

正常组肾组织切片中可见nephrin呈浅棕色染色沿肾小球毛细血管襻呈均匀、线状分布，肾小管有少量分布；干预组亦未见明显异常；模型组4周时nephrin表达较正常组显著减少，表达不均，稀疏，部分区域表达消失，较正常组及模型组差异有显著性（P＜0.01），WT1于MN4周末时在足细胞核的表达呈深棕色粗大颗粒，与正常组及干预组比较差异无显著性（P＞0.05）（见表2、图3）。

2.5 肾组织Nephrin蛋白、WT1蛋白与全血tPA、uPA、PAI-1相关性分析

相关性分析显示，模型组大鼠全血tPA和uPA水平与肾组织Nephrin蛋白的表达变化呈正相关（r= 0.8264，P＜0.05；r=0.8483，P＜0.05），全血PAI-1水平与肾组织nephrin蛋白的表达变化呈现负相关（r= -0.8152，P＜0.05）。全血tPA和uPA、PAI-1水平与肾组织WT1蛋白的表达变化则无明显相关（r1= 0.2372，r2=0.2531，r3=0.2483；均P＞0.05）。

表2 4周末各组肾组织nephrin、WT1的表达（±s，n=10）Tab.2 Expression level of nephrin and WT1 in the kidney tissues at the end of 4thweek

表2 4周末各组肾组织nephrin、WT1的表达（±s，n=10）Tab.2 Expression level of nephrin and WT1 in the kidney tissues at the end of 4thweek

注：模型组与正常组比较，*P＜0.05；模型组与干预组相比，#P＜0.05。Note.Compared with the normal group，*P＜0.05；Compared with the intervention group，#P＜0.05.

组别Groups　Nephrin　WT1正常组Normal　12.35±3.78　25.45±11.37模型组Model　5.62±2.03*#　22.60±14.16干预组Intervention　12.06±4.23　25.14±6.25

图3 4周末两组肾组织nephrin、WT1的表达情况Fig.3 Expression of nephrin and WT1 in the kidney tissues at the end of 4thweek

3 讨论

MN是一种常见的肾小球疾病，是成人肾病综合征最常见的病因，在原发性肾小球疾病导致的终末期肾病中是第二位或第三位的常见原因。其主要的病理改变是肾小球基底膜上皮下免疫复合物沉积伴GBM弥漫性增厚，临床表现为大量蛋白尿或者肾病综合征，常有髙凝状态存在，肾小球硬化、纤维化为各型肾小球疾病终末阶段所常见［1］。纤溶系统在膜性肾病的发生发展中发挥重要的作用。作为纤溶系统中重要的活性物质，tPA和uPA均能激活纤溶酶原，也是人类血液中仅有的两种纤溶酶原激活物，与uPA相比，tPA结构上的赖氨酸结合部位使其可特异性结合于纤维蛋白血凝块上，进而增加了溶血功能。uPA在各组织中广泛存在，尤其常见于结缔组织或细胞外组织，可局部活化细胞外间质中的纤溶酶原，形成纤溶酶进而降解大多数糖蛋白［3］。

PAI-1（纤溶酶原激活物抑制剂-1）是一种单链糖蛋白，相对分子质量52×103，含379个氨基酸，属丝氨酸蛋白酶抑制物家族［5］。其主要作用是通过与PA形成不可逆的复合物而灭活tPA（组织型纤溶酶原激活物）的活性，而在病理条件下高表达的PAI-1还能灭活uPA（尿激酶型纤溶酶原激活物）的活性，从而使纤维蛋白因无法降解而在组织中沉积下来，并导致细胞外基质合成增加、降解抑制，进而导致组织纤维化［5］。

本实验研究结果显示，从第二周末起，与正常组及干预组相比，模型组膜性肾病大鼠的血清tPA和uPA水平出现明显下降，而PAI-1水平则明显上升；相关性分析及各组细胞损伤及调亡的差异提示早期预防纤溶紊乱对防止MN进展有重要意义。

膜性肾病的一个重要特征是足细胞损伤。足细胞在膜性肾病病理状态各种损伤因素作用下可能发生若干足细胞特异蛋白分子（nephrin、WT-1等）表达的下调以及形态学变化，如细胞凋亡等［6］。作为一种高度分化成熟的细胞，足细胞的分裂增殖能力不强，因此足细胞的减少和丢失可作为反映肾小球损伤严重程度和肾硬化进展的重要观测指标及预测指标。Nephrin是近几年来在足细胞裂孔膜上发现的第一个跨膜糖蛋白，它特异地表达在足细胞的裂孔膜上，对于维持正常的肾小球滤过功能具有重大意义［7］。有研究发现nephrin参与足细胞的重要功能，目前多数研究者认为nephrin的减少与蛋白尿的发生关系密切［7-8］。足细胞特异性蛋白WTl（Wilms Tumor-1）是一种锌指样转录因子，定位于表达在足细胞核，它是足细胞特异性标志之一［9-10］。研究发现在局灶节段性肾小球硬化（FSGS）中，WTl表达下降［11］，本实验免疫组化实验结果显示，MN模型大鼠中nephrin和WT1蛋白的表达均明显减少，而nephrin蛋白表达的下调更为显著，差异有统计学意义，这与足细胞相对数目和密度的逐渐下调呈正相关关系，而干预组nephrin和WT1蛋白表达水平及足细胞数目及密度均较正常组无明显差异，相关性分析提示nephrin和 WT1蛋白的表达在维持足细胞数量中可能起重要作用，而足细胞nephrin和WTl蛋白表达的减少或可作为足细胞凋亡的标志，进而作为反映肾小球损伤严重程度和肾硬化进展的重要观测指标及预测指标。

综上，在大鼠MN模型构建的早期（第一周）即检测到纤溶系统的重要组成物质tPA、uPA的明显下调而PAI-1表达则明显上调，这与足细胞nephrin 和WTl蛋白表达下调，足细胞凋亡加剧等趋势保持一致，干预治疗及相关性分析提示早期通过监测血浆中纤溶系统动态变化初步估计足细胞损伤凋亡情况是可行的，本研究从分子水平揭示MN从蛋白尿到足细胞损害肾小球硬化的发病机制。

参考文献

［1］ Wang J，Zhu P，Cui Z，et al.Clinical features and outcomes in patients with membranous nephropathy and crescent formation ［J］.Medicine（Baltimore），2015，94（50）：e2294.

［2］ Kunamneni A，Durvasula R.Streptokinase-A drug for thrombolytic therapy：a patent review［J］.Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2014，9（2）：106-121.

［3］ 张燕.膜性肾病大鼠足细胞转分化情况及川芎嗪对其影响的实验研究［D］.泸州：泸州医学院，2011：15-17.

［4］ Meyer-Schwesinger C，Meyer TN，Sievert H，et al.Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 activity induces polyubiquitin accumulation in podocytes and increases proteinuria in rat membranous nephropathy［J］.Am J Pathol，2011，178（5）：2044-2057.

［5］ Treweeke AT，Maskrey BH，Hickson K，et al.Iodixanol has a favourable fibrinolytic profile compared to iohexol in cardiac patients undergoing elective angiography：A double-blind，randomized，parallel group study［J］.PLoS One，2016，11（1）：e0147196.

［6］ PLOS ONE Staff.Correction：Endocytosed β2-microglobulin amyloid fibrils induce necrosis and apoptosis of rabbit synovial fibroblasts by disrupting endosomal/lysosomal membranes：A novel mechanism on the cytotoxicity of amyloid fibrils［J］.PLoS One，2015，0141631.

［7］ 杨维娜，任淑婷，钱亦华，等.阿霉素肾病大鼠肾小球中足细胞数量及nephrin、VEGF的表达变化 ［J］.四川大学学报（医学版），2010，41（3）：458-463.

［8］ 李秋月，李六生，李桂霞，等.坎地沙坦对糖尿病肾病大鼠足细胞Nephrin、Podocin和CD2AP表达的影响 ［J］.华中科技大学学报（医学版），2012，41（3）：310-314.

［9］ Sangkhathat S，Maneechay W，Chaiyapan W，et al.Association of Wilms’tumor 1 gene single-nucleotide polymorphism rs16754 with colorectal cancer［J］.Mol Clin Oncol，2015，3（6）：1401-1405.

［10］ Shimodaira S，Sano K，Hirabayashi K，et al.Dendritic cellbased adjuvant vaccination targeting Wilms’Tumor 1 in patients with advanced colorectal cancer［J］.Vaccines（Basel），2015，3（4）：1004-1018.

［11］ Iijima K，Someya T，Ito S，et al.Focal segmental glomerulosclerosis in patients with complete deletion of one WT1 allele［J］. Pediatrics，2012，129（6）：e1621-5.

【中图分类号】Q95-33

【文献标识码】A

【文章编号】1005-4847（2016）03-0283-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.013

［基金项目］四川省卫生厅科研课题（编号：110238）。

［作者简介］梁静（1981-），女，硕士，主治医师，主要从事肾脏纤维化相关疾病的研究。Email：liangjing9743@163.com。

［通讯作者］王莉（1962-），女，博士，主任医师，从事各种肾脏疾病的诊断治疗及血液透析、腹膜透析技术的研究。Email：scwangli62@ 163.com。of early phase of MN podocyte injury may be another therapy target for prevention of the disease development，and then provide new ideas for clinical research and drug development for MN.

Corresponding author：WANG Li，Email：scwangli62@163.com

［收稿日期］2016-02-23

Effect of fibrinolytic system on the podocyte injury in rats with membranous nephropathy

LIANG Jing1，ZHANG Yuan2，CAO Ling3，MENG Xiang-long1，WANG Li2*
（1.Department of Nephrology，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People’s Hospital East Branch，Chengdu 610110，China；2.Department of Nephrology，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072；3.Department of Nephrology，Affiliated Hospital to Luzhou Medical College，Luzhou 646000）

【Abstract】Objective To observe the expression of uPA，tPA and PAI-1 in whole blood of rat membranous nephropathy（MN）models induced by cationic bovine serum albumin（C-BSA），and to explore the effect of fibrinolytic system on podocyte apoptosis and pathological changes.To explore the possible preventive and therapeutic effects and the possible mechanisms of early prevention of fibrinolysis.Methods We developed a MN model with the modified Border method.At the end of the 1st，2nd，3th，and 4th week of immunization，respectively，the levels of whole blood uPA，tPA and PAI-1 were determined by ELISA.The rat kidney tissues were examined by light microscopy and electron microscopy to identify the pathological changes.The expression levels of nephrin and WTl were detected with immumofluorescence staining and their correlation was analyzed.Results Compared the treatment group with control group，the levels of whole blood uPA，tPA and PAI-1 of the model group were decreased，while PAI-1 was elevated，showing a significant difference（P＜0.05）.The degree of renal interstitial fibrosis was more serious.Correlation analysis showed that the whole blood tPA and uPA levels were positively correlated with the changes of nephrin protein expression in the kidney tissue，while the whole blood PAI-1 level was negatively correlated with the nephrin protein expression in the kidney tissue.Conclusions In the process of MN development，the fibrinolytic system may have important significance for podocyte apoptosis.Determination

【Key words】Kidney；Membranous nephropathy；Podocyte；Nephrin；WT-1；Fibrinolytic system；Rats；Pathology