张佑民

【摘要】 目的 研究 microRNA-21参与乳腺癌侵袭转移的调控机制。方法 采用实时定量反转录 -聚合酶反应 （RT-PCR）方法检测MDA-435、MDA-231和 MCF-7乳腺癌细胞株 microRNA-21的表达；采用 transwell方法测定上述三株乳腺癌细胞体外侵袭转移能力；人工合成 microRNA-21干扰序列 ， 转染MDA-231、MDA-435乳腺癌细胞 ， 观察对细胞侵袭能力的影响；应用 Western blot检测逆转诱导蛋白（RECK）的表达；采用荧光报告基因实验检测 RECK与 microRNA-21的结合情况。结果 MCF-7、MDA-231及 MDA-435细胞株中均具有 microRNA-21高表达 ， 且表达量 MDA-435>MDA-231>MCF-7， 其中 ， 具有高侵袭特性的 MDA-435细胞具有最高水平 microRNA-21的表达为 （4.51±0.71）， MDA-231细胞具有中等水平的 microRNA-21表达为 （2.67±0.27）， MCF-7细胞表达microRNA-21水平相对较低为 （1.23±0.11）， 比较差异有统计学意义（P<0.01）。三株细胞中 ， MDA-435细胞侵袭力最高为（425.4±35.0）细胞数/视野 ， MCF-7最低为（142.7±13.4）细胞数/视野 ， MDA-231居中为（263.7±24.4）细胞数/视野 ， 三组细胞侵袭力比较差异有统计学意义（P<0.01）。将 anti-microRNA-21分别转染入 MDA-231和 MDA-435细胞 ， 与对照组比较 ， 两种细胞株转染 anti-microRNA-21后分别引起 56%和 67%的 microRNA-21表达量降低 ， 比较差异有统计学意义（P<0.05）。将anti-microRNA-21转染入MDA-231细胞， 与阴性对照组比较 ， anti-microRNA-21引起了 34%细胞侵袭数目的减少。将 anti-microRNA-21转染入 MDA-435细胞 ， 结果表明 anti-microRNA-21引起68%侵袭细胞数目的下降。Western blot检测显示 ， microRNA-21表达下调， MDA-435细胞中 RECK表达明显增强；荧光素酶实验显示共转染 RECK和 anti-microRNA-21的 MDA-435细胞荧光酶活性增加38%。结论 本研究提示 microRNA-21可促进乳腺癌侵袭转移 ， 其作用可能与逆向调控 RECK有关。

【关键词】 乳腺癌；侵袭；microRNA-21；伴 Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白；RNA干扰

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.16.195

【Abstract】 Objective To research regulation mechanism of microRNA-21 for breast cancer invasion and metastasis. Methods Real-time quantification polymerase chain reaction （RT-PCR） was applied to detect miR-21 expression in MDA-435， MDA-231 and MCF-7 breast cancer strains. In vitro invasion and metastasis of these three strains were detected by transwell method. Transfection on MDA-231 and MDA-435 cell was made by synthetic microRNA 21 interference sequence to observe the influence on cell invasion. Reversion-inducing cysteine-richprotein with Kazalmotifs （RECK） protein expression was detected by Western blot， and combination of RECK and microRNA-21 was detected by luciferase reporter gene test. Results All MCF-7， MDA-231 and MDA-435 strains had high expressed microRNA-21， and their expression volume were shown as MDA-435>MDA-231>MCF-7. MDA-435 with high invasion feature showed the highest microRNA-21 expression level as （4.51±0.71）， followed by microRNA-21 expression in MDA-231 as （2.67±0.27） and in MCF-7 as （1.23±0.11）， and their difference had statistical significance （P<0.01）. Among the three strains， MDA-435 had the highest cell invasion as （425.4±35.0） cell number/vision， MCF-7 had the lowest as （142.7±13.4） cell number/vision， and MDA-231 as （263.7±24.4） cell number/vision. The difference of cell invasion had statistical significance across the three strains （P<0.01）. MDA-231 and MDA-435 cells received transfection of anti-microRNA-21. Comparing with the control group， transfection of anti-microRNA-21 in the two cell strains showed respectively 56% and 67% decreased microRNA-21 expression， and their difference had statistical significance （P<0.05）. Comparing with the negative control group， MDA-231 with transfection of anti-microRNA-21 showed 34% decreased cell invasion count. MDA-435 with transfection of anti-microRNA-21 showed 68% decreased cell invasion count. Western blot test Detection by Western blot showed down-regulated microRNA-21 expression and enhanced RRECK expression in MDA-435 cell. Luciferase test showed increased fluorescence enzyme activity by 38% in MDA-435 cell with RECK and anti- microRNA-21 transfection. Conclusion This research shows promotion of breast cancer invasion and metastasis by microRNA-21， and its effect may have relationship with reverse regulation of RECK.

【Key words】 Breast cancer； Invasion； microRNA-21； Reversion-inducing cysteine-richprotein with Kazalmotifs； RNA interference

microRNAs是新近识别的人体内一类内源性非编码小分子核糖核酸 （RNA）， 通过与靶基因互补结合 ， 在转录后水平调控靶蛋白表达 ， 从而参与生物体各项生物学活动。前期研究显示[1]， microRNA-21在乳腺癌细胞中高表达并与阿霉素耐药有关 ， 并有研究提示[2]， microRNA-21高表达与乳腺癌患者转移有关。本研究拟采用 RNA干扰技术降低 microRNA-21的表达 ， 观察对乳腺癌细胞侵袭转移的影响 ， 并观察对其潜在靶基因：伴Kazal域的富含半胱氨酸的 RECK的表达调控。本研究旨在为深入阐述乳腺癌侵袭转移调控机制提供实验室依据。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 细胞株 人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-231和 MDA-435由山东省肿瘤防治研究院基础研究中心常规保存。于含10%小牛血清的细胞冻存培养基 （DMEM）中 ， 37℃、5% CO2条件下常规培养。

1. 1. 2 主要试剂和仪器 脂质体 Lipofectamine 2000、Trizol试剂、实时定量 RT-PCR试剂盒、matrigel胶购自美国 Invitrogen 公司 ， transwell小室购自美国 Coning公司 ， 蛋白提取试剂盒购自生工生物工程 （上海 ）股份有限公司。RE……