杨利玲,雷以会,徐　平



贵州遵义地区蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段的检测

杨利玲,雷以会,徐平

遵义医学院第一附属医院神经内科，遵义563500

摘要：目的了解贵州遵义地区蝙蝠博尔纳病病毒(BDV)感染情况。方法采用巢式逆转录聚合酶链反应(nRT-PCR)检测82例蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段，阳性产物进行基因序列测定、同源性及分子系统树分析。结果在82例蝙蝠脑组织中检测出7例BDV-RNA P24基因片段阳性，只有5例成功测出BDV-P24基因片段，与标准株马源Strain V相比较同源性高达99%，出现2个位点的一致性沉寂突变(nt1650T～C，nt1740G-T,突变率为0.9%)，与H1766比较其同源性达97%，出现5个位点的一致性沉寂改变(nt1599A～G，nt1671T～C，nt1677T～C，nt1695G～A，nt1740G～T,突变率为2.2%)，与He/80比较起同源性为96%，出现7个位点的一致性沉寂改变(nt1566 G～A，nt1581C～T，nt1659 T～C，nt1668 A～G，nt1674 T～C，nt1695 G～A，nt1740 G～A，突变率为3.1%)。结论贵州遵义绥阳地区蝙蝠存在BDV感染，与马源Strain V存在高度同源性，人感染BDV可能存在潜在的动物源性。

关键词：博尔纳病病毒；蝙蝠；nRT-PCR；P24

博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)是一种有包膜、未分节段单股负链、嗜神经性的核糖核酸病毒，是博尔纳病毒科、博尔纳病毒属家族中目前唯一的成员。最早发现于德国的Borna镇，在当地战马中暴发一类不明原因致死性脑炎，有学者在动物尸体的脑组织中检测出病毒，就以该镇而命名为“博尔纳病病毒”。BDV有着广泛的自然感染宿主，从鸟类到包括人类在内的大多数恒温哺乳动物，例如马、羊、猫、牛、犬、羊驼、狐狸、猴等[1]，国内外研究已证实马和羊为其最主要的自然感染宿主。随着科技水平的发展，发现BDV有着更广阔的感染动物种系，日本学者发现浣熊感染BDV的证据[2]，在我国重庆、宁夏、贵州以及新疆等地区已有动物脑组织和外周血中发现感染BDV的相关报道。近年来研究发现在蝙蝠体内已经分离出80余种来源于动物且可感染人类的病原体[3]，例如狂犬病毒、乙型脑炎病毒等人兽共患病病毒，其中也包括许多新型的人兽共患病病毒，比如马来西亚暴发的尼帕病毒病、澳大利亚暴发的亨德拉病毒病以及近几年爆发较为频繁的西尼罗病毒病等均被证明蝙蝠为这些病毒的自然感染宿主。目前，国、内外尚未有蝙蝠感染BDV的相关文献。为此，我们采用传统的nRT-PCR对82只蝙蝠的脑组织BDV-P24基因片段进行检测，并对PCR阳性产物测序，以了解遵义地区蝙蝠BDV自然感染状况，探讨BDV种系来源，并与标准株Stain V、H1766、He/80比较分析其同源性。实验结果报告如下。

1材料和方法

1.1实验材料全部82只蝙蝠均采自遵义地区野生蝙蝠，采集时间为2014年5月至2014年9月。从蝙蝠中采取的脑组织标本放入去酶的1.5 mL EP管，并立即放于-80 ℃的超低温冰箱保存。采集过程中严格按照无菌操作收集标本，避免样品间交叉污染。

1.2引物根据GenBank BDV基因保守区第二开放阅读区(ORFII)的核苷酸序列设计2对引物。

外引物序列长度为512 bp，

P1：AGACACTACGACGGGAACGA

P2：TGGGAGCTGGGGATAAATGC。

内引物序列长度为270 bp，

P3：GCATGATCGAGGCTGAGGAG

P4：GCAACATGGGTGCAGAGGTC，

引物由上海生工有限公司合成。

1.3主要仪器凝胶成像系统Chemidoc XRS(美国应用生物系统公司)、RTC0200 DNA Engine PCR仪、紫外分光光度计 Nanodrop 1000(基因有限公司)。

1.4方法全部标本均采自蝙蝠的新鲜脑组织，重量约为110～150 mg，分装于去酶的1.5 mL EP管中并编号，-80 ℃超低温冰箱保存。所有仪器和试管均经过高压灭菌、去RNA酶处理。

1.4.1RNA的提取及质量检测取50 mg左右的蝙蝠脑组织于已高温灭菌的玻璃匀浆管中，加入1 mL的Trizol试剂，采用灭菌后的玻璃研磨棒研磨，直至研磨为匀浆液。用Trizol一步法提取RNA。提取的RNA样本用紫外分光光度计测定RNA的浓度以及OD260/OD280值，以检测RNA的质量，OD260/OD280值介于1.8～2.1认为提取RNA质量较好。将提取的RNA样本于-80 ℃低温冰箱保存。

1.4.2BDV P24基因片段的检测采用nRT-PCR方法。在进行BDV检测的全部环节中均设置阴性对照和阳性对照，以去酶的DRPC水为阴性对照以排除假阳性，同时使用BDV感染的OL细胞为阳性对照以排除假阴性(阳性对照标本为重庆医科大学所提供)。(1)RNA逆转录成cDNA：将所提取的RNA样本放于室温中。反应体系为10 μL：VRNA=500 ng/RNA样本浓度，5×Prime Script RT Master Mix 2 μL，去酶的DEPC补足10 μL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保持。(2)第1轮PCR反应体系25 μL：2×GoTaq Master Mix 12.5 μL，外上、下游引物各1 μL，cDNA样本2 μL，去酶的ddH2O 8.5 μL。反应条件：预变性95 ℃ 2 min，变性 95 ℃ 30 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，共22个循环，延伸 72 ℃ 5 min，保持 4 ℃ 5 min。(3)第2轮PCR反应体系：2×GoTaq Master Mix 12.5 μL，内上、下游引物各1 μL，第一轮PCR产物2 μL，去酶的ddH2O 8.5 μL。反应条件：预变性95 ℃ 2 min，变性 95 ℃ 30 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，共22个循环，延伸 72 ℃ 5 min，保持 4 ℃ 5 min。

1.4.3测序将第2轮PCR产物进行琼脂糖电泳，并在凝胶成像系统观察结果。最后将阳性的PCR产物进行纯化和克隆，由英捷有限公司进行测序。

1.4.4序列分析登陆NCBI，应用BLAST软件，将测序结果和GenBank上提供的标准株He/80、Strain V、H1766等进行比对分析，使用DNAman8绘制系统发生树。

2结果

2.1PCR扩增产物电泳应用nRT-PCR方法对蝙蝠脑组织 BDV-P24基因片段进行检测。1%琼脂糖电泳有7份PCR产物大约在250 bp处可见明显条带，阴性对照未出现条带。见图1。

2.2测序及序列分析对7份PCR阳性产物进行纯化、测序，仅有5份测序成功，阳性率为6.1%，另外两份因浓度太低而未测出。登陆NCBI和序列比对，阳性PCR产物扩增片段证实为BDV-P24基因片段(nt1 528～nt1 750)，蝙蝠BDV-P24测序结果与GenBank所提供的标准株的相似性达96%～99%。与标准株马源Strain V(GenBank编号：AJ311521.1)相比较同源性高达99%，出现2个位点的一致性沉寂突变(nt1650T～C，nt1740G-T,突变率为0.9%)，与H1766(GenBank编号：AJ311523.1)比较其同源性达97%，出现5个位点的一致性沉寂改变(nt1599A～G，nt1671T～C，nt1677T～C，nt1695G～A，nt1740G～T,突变率为2.2%)，与He/80(GenBank编号：AJ311522)比较起同源性为96%，出现7个位点的一致性沉寂改变(nt1566 G～A，nt1581C～T，nt1659 T～C，nt1668 A～G，nt1674 T～C，nt1695 G～A，nt1740 G～A，突变率为3.1%)。

+ was positive control, - was negative control, 1-7 were test specimens.

图17例阳性PCR产物电泳结果。其中+为阳性对照，-为阴性对照，1-7为实验标本

Fig.1Electrophoresis results of 7 positive nRT-PCR products

2.3系统发生树分析重构系统发生树发现，在核苷酸水平上可见4例蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段汇聚形成贵州独立支系，1例蝙蝠脑组织BDV-P24的基因序列与精神疾病患者PBMC中BDV-P24基因序列(GenBank No.L76236)形成独立支系。见图2。

图2　BDV分子系统树分析

3讨论

博尔纳病病毒(borna disease virus,BDV)为博尔纳病的病原体，博尔纳病为免疫介导的中枢的脑脊髓炎，感染动物以精神行为异常为主要临床症状，人类则表现为神经精神疾病症状。BDV是一种嗜神经的RNA病毒，感染途径可能以口、鼻、眼等处的分泌物以及血液进行传播，在自然环境中人和动物直接或间接接触被污染的食物、水而发生感染。

BDV有着广泛的自然感染宿主，国内已有许多关于BDV分子流行病学调查的相关报道。国内学者采用荧光定量结合巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法对多种物种进行BDV检测。何丰[4]检测新疆伊犁地区100只牧羊犬PBMC和脑组织中P24阳性率分别为5%、9%,刘建[5]对宁夏地区163只绵羊脑组织检测P24阳性率为3.68%。本课题组前期成员王长明[6]、刘海军[7]采用FQ-nRT-PC分别对贵州省以及周边地区的300只山羊和120只牛的PBMC进行检测，阳性率分别为0.67%、4.17%。 Wensman[8]发现健康猫BDV阳性率为16%(4/25)。

本研究采用巢式RT-PCR对82份蝙蝠脑组织进行BDV-P24检测，发现其阳性率为6.1%，说明遵义绥阳地区存在有一定程度的BDV感染。但均高于前期成员报道遵义地区牛和山羊的BDV阳性感染率，与重庆、新疆、宁夏等地区的恒温动物的BDV阳性感染也有一定的差别，可能原因有以下几个方面：1)本实验以蝙蝠脑组织为检测对象，脑组织中BDV RNA的含量较PBMC中丰富，故本实验BDV阳性感染率较高。2)不同地区、不同物种BDV感染率不同。3)急性感染BDV后，大部分病毒颗粒被免疫系统清除，血清中仅存在少量的病毒颗粒，但在中枢神经系统中依然存在持续感染[9]。本实验引物设计是选取BDV-P24高度保守序列区，且测序结果与标准株的同源性达96%～99%，仍存在个位点的突变，说明感染蝙蝠的BDV存在基因多样性。王长明曾报道遵义部分地区山羊存在BDV的自然感染，并且2头BDV阳性的山羊均来自绥阳地区，说明遵义绥阳地区为疫源的高风险地区，若BD爆发或流行，遵义绥阳地区可能为先发的流行区之一。从重构的分子系统发生树中可发现5例阳性标本隶属于2个支系。4例蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段形成贵州独立支系的可能原因：1)不同地区形成不同的BDV株系。2)由于自然选择对变异的作用大小不同，由该地区的BDV株系基因突变而成[10]。1例与国外精神病人单独汇聚为一株系，有较高的同源性，说明BDV可以在动物与动物、动物与人类之间循环传播。

综上所述，贵州省遵义地区蝙蝠存在BDV自然感染，人感染BDV存在潜在动物源性。由于标本均来自本地，并且标本数量较少，无法做出全面的解释，后续研究还需扩大标本数量并进行其它地区的分子流行病学研究，并开展本省BDV病毒株分离工作，为预防和控制贵州省BDV的流行奠下基础。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.011

通讯作者：徐平;Email:xuping527@vip.sina.com

中图分类号：R373

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)02-0156-04

收稿日期：2015-06-08；修回日期:2015-09-22

Borna disease virus p24 in brain tissue of bat infect in Zunyi, Guizhou Province, China

YANG Li-ling,LEI Yi-hui, XU Ping

(The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563500, China)

Abstract:The p24 gene fragment of BDV-RNA in brain tissue of bat was detected by nested reverse transcriptase polymerase chain reaction (nRT-PCR) in Zunyi, Guizhou Province. The positive PCR products were analyzed by genetic sequence homology and molecular phylogenetic tree. Result showed that the P24 gene fragment of BDV-RNA in brain tissue from 82 bats was 7 positived. There was only 5 positive products could be successfully detected. The homology of p24gene fragment of BDV was 99%, with 2 situs consistency silent mutation when compared with standard strain V in horse (nt1650T-C, nt1740G-T, mutation rate of 0.9%). The homology of p24 gene fragment of BDV was 97%, with 5 situs consistency silent mutation when compared with H1766 (nt1599A-G, nt1671 T-C, nt1677 T-C, nt1695 G-A, nt1740 G-T, mutation rate of 2.2%). The homology of p24 gene fragment of BDV was 96%, with 7 situs consistency silent mutation when compared with He80 (nt1566 G-A, nt1581 C-T, nt1659 T-C, nt1668 A-G, nt1674 T-C, nt1695 G-A, nt1740 G-A, mutation rate of 3.1%). There is BDV natural infection probably originated from bat, highly homology with strain V in horse in Zunyi, Guizhou Province.

Keywords:Borna disease virus; bat; nRT-PCR; P24

国家自然科学基金项目(No.31160210)资助

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31160210)

Corresponding anther: Xu Ping, Email: xuping527@vip.sina.com