吴素叶, 薛阿利, 赵朴, 刘凌云, 蒋蕾, 朱小春

(1.温州医科大学附属第三医院 血液科，浙江 瑞安 325200；2.温州医科大学附属第一医院 风湿免疫科，浙江 温州 325000)

沙利度胺联合甲氨蝶呤对类风湿性关节炎患者外周血调节性T细胞及细胞因子IL-6表达的调节作用

吴素叶1, 薛阿利1, 赵朴1, 刘凌云1, 蒋蕾1, 朱小春2Δ

(1.温州医科大学附属第三医院 血液科，浙江 瑞安 325200；2.温州医科大学附属第一医院 风湿免疫科，浙江 温州 325000)

目的 分析沙利度胺联合甲氨蝶呤(thalidomide+methotrexate, T+M)治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)前后调节性T细胞比例及细胞因子白介素-6(interleukin- 6，IL-6)表达情况，揭示T+M治疗RA作用机制。 方法 选取2014年8月～2016年8月温州医科大学附属第三医院血液科就诊治疗的类风湿性关节炎58例患者，沙利度胺联合甲氨蝶呤治疗前后流式细胞术检测外周血调节性T细胞比例，对比分析T+M治疗前后调节性T细胞比例变化；酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测外周血中淋巴细胞分泌细胞因子IL-6表达情况。结果 T+M治疗后组RA患者外周血调节性T细胞(CD25+Foxp3/CD4+)比例较治疗前组明显增加；然而，T+M治疗后组IL-6表达水平同治疗前组相比明显下降。 结论 T+M治疗RA可能是通过增加调节性T细胞以及减少细胞因子IL-6而调控T细胞稳态而起作用。

沙利度胺；甲氨蝶呤；类风湿性关节炎；调节性T细胞；IL-6

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一类以滑膜炎为主的慢性炎症性疾病，可累积机体多器官严重危害人体健康的全身性自身免疫疾病。类风湿性关节炎在南半球发病率为0.5%～1%，且从南至北、从城市到农村，发病率呈现降低趋势。类风湿性关节炎造成个人及社会承受重大负担。对于个人来说，类风湿性关节炎引起骨骼肌肉病变，严重者可出现物理功能障碍。同时，RA导致患者生活质量下降及累积共病风险(如心血管系统疾病)。对于社会而言，医疗支出、个体工作能力减弱及社会活动参与度下降都将带来巨大的社会经济负担[1]。

目前，类风湿性关节炎治疗以生物抑制剂为主，生物抑制剂可有效控制疾病活动，且可有效控制心血管风险事件发生。但是，生物抑制剂一些重要的临床实践及临床研究报道了某些生物抑制剂(特别是TNF单克隆抗体等)可引发心律失常[2]。继而，抗类风湿性关节炎滑膜血管新生治疗为RA治疗提供了新的方向。沙利度胺是因其抗血管新生和免疫调节作用受到了广泛关注。临床研究发现无论沙利度胺单独或联合甲氨蝶呤用药均有效，沙利度胺同甲氨蝶呤具有相互调节，互相促进作用[3]。

本研究着重临床寻究，本着沙利度胺联合甲氨蝶呤的临床疗效，借以通过调节性T细胞及细胞因子IL-6表达情况，寻找沙利度胺联合甲氨蝶呤治疗RA的可能机制。既往综述报道了T细胞与RA之间的关联性，表明调节性T细胞在RA的发生发展过程中具有重要的意义[4]。淋巴细胞分泌的IL-6同类风湿关节炎的关键细胞因子，也是沙利度胺和甲氨蝶呤免疫调节的作用点。故本研究期待找到沙利度胺联合甲氨蝶呤应用于RA治疗的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年8月～2016年8月温州医科大学附属第三医院血液科就诊治疗的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者58例，征得RA患者参与研究的知情同意，其中男20例，女38例，年龄19～62岁，平均年龄(44.6±8.2)岁，病程0.5～6年，平均病程(3.2±1.1)年。所有患者均符合美国风湿病学会的诊断标准[5]，排除心脑血管疾病共病存在。本研究经过本院伦理委员会批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法：沙利度胺(常州制药厂有限公司，国药准字H32026129)用药剂量根据患者耐受程度依次递加，第1周口服沙利度胺50 mg/d，第2周服用沙利度胺75 mg/d，第3周服用沙利度胺100 mg/d，联合甲氨蝶呤(上海信谊药厂有限公司，国药准字H31020644)10 mg，口服，1次/周，治疗持续时间3个月。

1.2.2 检测方法：调节性T细胞检测：取类风湿性关节炎患者T+M治疗前后外周血2 mL置于肝素钠抗凝EDTA管，应用流式细胞仪(美国BD FACSCalibur全自动多色分析流式细胞仪系统)检测外周血中调节性T细胞占有百分比。

细胞因子白介素-6(interleukin- 6，IL-6)检测：同样取RA患者T+M治疗前后外周血2 mL置于肝素钠抗凝管中，5 min后加入Hank’s液，手动轻轻摇匀，用毛细血管吸取抗凝血，沿管壁缓慢加入另一含淋巴细胞分离液的试管中，平衡后置于水平离心机中2000 r/min离心10 min，毛细血管吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层于一刻度管中，加入Hank’s液于5 mL处，混匀，平衡后2000 r/min离心10 min，弃上清获淋巴细胞。淋巴细胞梯度稀释后分别应用酶标仪(美国Thermo赛默飞Maltikan FC酶标仪)检测，人源CD4、CD25抗体均购自美国BD，人源IL-6 ELISA检测试剂盒购自英国Abcam。

2 结果

2.1 T+M治疗RA前后2组调节性T细胞检测结果 T+M治疗RA前后2组调节性T细胞检测结果如下：T+M治疗后RA患者外周血调节性T细胞(CD25+Foxp3/CD4+)比例为[(16.04±0.86)%]，而T+M治疗前RA患者外周血调节性T细胞比例为[(8.56±0.45)%]。T+M治疗后较治疗前明显升高，经统计学分析，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 治疗前后某患者的调节性T细胞检测结果Fig.1 The results of regulatory T cells in patients before and after treatment

2.2 T+M治疗RA前后2组淋巴细胞IL-6表达结果 T+M治疗后RA患者外周血分离淋巴细胞中IL-6浓度为[(28±15)pg/mL]，而T+M治疗前RA患者外周血分离淋巴细胞中IL-6浓度为[(45±21)pg/mL]。同T+M治疗前组相比，T+M治疗后RA患者外周血分离淋巴细胞中IL-6浓度显著下降，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

类风湿性关节炎是风湿科常见疾病之一，同时也是一类至今发病机制尚未明确的全身自身免疫疾病之一。近年来多种治疗方案被尝试应用于类风湿性关节炎，包括沙利度胺联合甲氨蝶呤用药都被证实具有一定疗效，但未见治疗作用机理报道。且近年来调节性T细胞和细胞因子IL-6等在RA的发病机制中的作用被众多学者关注[4]。

本研究发现沙利度胺联合甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎后外周血中调节性T细胞明显升高，反之，外周血分离淋巴细胞分泌细胞因子IL-6显著下降。究其缘由，本研究认为T+M治疗RA作用机制包含通过调控调节性T细胞及部分细胞因子分泌进行免疫调节。

CD4+CD25+调节性T细胞是一类主动免疫调节T细胞，具有控制自身免疫反应及维持外周免疫耐受作用，且CD4+CD25+调节性T细胞可通过细胞因子分泌水平调控CD8+T细胞分化[6]。研究表明调节性T细胞数量及功能异常可能是类风湿性关节炎发生发展的重要原因，RA患者外周CD4+T细胞所包含的T细胞受体重排切除环大量减少，受体重排切除环阳性T细胞缺失是RA患者外周T细胞稳态失衡的主要原因[7]。沙利度胺作为一种免疫调节剂被广泛应用于抗肿瘤和抗风湿疾病的治疗，既往研究主要集中报道了沙利度胺抗血管新生活性与抗风湿治疗之间的关联性[8]。本研究发现免疫调节剂沙利度胺联合抗叶酸类药物甲氨蝶呤可显著提升RA患者外周调节性T细胞的数量，从而调节RA患者失衡的外周T细胞。

细胞因子IL-6是一类重要物质参与免疫反应及动态平衡维持，细胞因子平衡网络被打破，将会引起炎症或自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎[9]。既往研究发现IL-6和TNF-β共同作用于CD4+T细胞，使之分化为Th17细胞，且只有IL-6存在下，CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞仍可自我分化为Th17细胞[10-11]。IL-6是调节性T细胞向Th17转化的关键因子[12]。本研究发现T+M联合治疗可显著升高外周淋巴细胞IL-6表达，抑制调节性T细胞想Th17转化，进一步调控失衡的T细胞稳态。

受本单位条件所限，本研究检测的细胞因子表达情况是指外周血分离所获淋巴细胞分泌情况，而不是T淋巴细胞直接的表达情况，故可能会存在B淋巴细胞的作用。期待各位研究者后续能够进一步分离T淋巴细胞，检测RA患者T淋巴细胞细胞因子受沙利度胺联合甲氨蝶呤治疗的影响。

综述，沙利度胺联合甲氨蝶呤可通过调节性T细胞以及细胞因子IL-6调控外周T细胞稳态，此作用可能是沙利度胺联合甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎的作用机制之一。

[1] Smolen JS,Aletaha D,Mclnnes LB.Rheumatoid Arthritis[J].Lancet,2016.doi: 10.1016/S0140-6736(16)-30173-8.

[2] Lazzerini PE,Capecchi PL,Galeazzi M,et al.Biologic drugs and arrhythmic risk in chronic inflammatory arthritis:the good and the bad[J].Immunol Res,2016.doi: 10.1007/s12026-016-8833-7.

[3] 张育，何斌，李国青，等.沙利度胺联合甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎的疗效观察[J].中国医药，2007，2(11)：641-642.

[4] 李巧霞，丛斌，单保恩.T细胞与类风湿性关节炎[J].国际免疫学杂志，2011，34(1)：1-5.

[5] Arnett FC,Edworthy SM,Bloch DA,et al.The American rheumatism association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,1988,31(3):315-324.

[6] McNally A,Hill GR,Sparwasser T,et al.CD4+CD25+regulatory T cells control CD8+ T-cell effector differentiation by modulating IL-2 homeostasis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(18):m7529-7534.

[7] Koetz K,Bryl E,Spickschen K,et al.T cell homeostasis in patients with rheumatoid arthritis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(16):9203-9208.

[8] 刘曦, 刘爱京, 邵富灵.沙利度胺治疗风湿性疾病机制的研究[J].中华风湿病学杂志, 2006, 10(6): 366-368.

[9] Kaneko S,Kondo Y,Yokosawa M,et al.Rheumatoid arthritis and cytokines[J].Nihon Rinsho,2016,74(6):913-918.

[10] Weaver CT,Hatton RD,Mangan PR,et al.IL-17 family cytokines and expanding diversity of effector T cell lineages[J].Annu Rev Immunol,2007,25:821-852.

[11] Xu L,Kitani A,Fuss I,et al.Cutting edge: regulatory Tcells induce CD4+CD25-Foxp3-T cells or are self-induced to become Th17 cellsin the absence of exogenous TGF-bate[J].J Immunol,2007,178(11):6725-6729.

[12] Kimura A,Naka T,Kishimoto T.IL-6-dependent and independent pathways in the development of interleukin 17-producing T helper cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(29):12099-12104.

(编校：薛雪)

Effect of thalidomide combined with methotrexate on expression of regulatory T cells and IL-6 in rheumatoid arthritis

WU Su-ye1, XUE A-li1, ZHAO Pu1, LIU Ling-yun1, JIANG Lei1, ZHU Xiao-chun2Δ

(1.Department of Hematology, The Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Ruian 325200, China; 2 Department of Rheumatology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of before and after combination therapy of thalidomide and methotrexate (T+M) on regulatory T cells and IL-6 expression profile,and to reveal the mechanism of therapeutic effect of T+M on rheumatoid arthritis.MethodsA total of 58 patients with rheumatoid arthritis from August 2014 to August 2016 in the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University.The flow cytometry assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were used to estimate the ratio of peripheral blood regulatory T cells and expression profile of IL-6 in peripheral blood lymphocyte before and after combination therapy of thalidomide and methotrexate.ResultsAfter combination therapy of T+M,the ratio of peripheral blood CD25+Foxp3/CD4+T cells had a marked increase compared with before combination of therapy of T+M;but the expression of IL-6 had a significant decrease in the group of after combination therapy of T+M compared with before combination therapy.ConclusionThe effect of combination therapy of T+M on rheumatoid arthritis is associated with increasing the ratio of regulatory T cells and decreasing the secretion of IL-6 that could regulate T cells to homeostasis.

thalidomide; methotrexate; rheumatoid arthritis; regulatory T cells; IL-6

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.012

吴素叶，女，本科，主治医师，研究方向：风湿病学，E-mail:wfswusuye@yahoo.com；朱小春，通信作者，男，本科，主任医师，研究方向：风湿免疫性疾病、疑难风湿病症，E-mail:wfyzhuxiaochun@163.com。

R593.22

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