唐秀凤　年宏蕾　杨　燕　许利平　王秀娟　刻仁慧

1.首都医科大学中医药学院，北京　100069；2.中医络病研究北京市重点实验室，北京　100069

淫羊藿女贞子及其有效组分对地塞米松干预哮喘大鼠气道病理改变的影响

唐秀凤1年宏蕾1杨燕1许利平1王秀娟1刻仁慧1，2

1.首都医科大学中医药学院，北京100069；2.中医络病研究北京市重点实验室，北京100069

目的研究淫羊藿女贞子水提物及其有效组分配伍地塞米松全身干预对哮喘大鼠气道病理改变的影响。方法42只SD大鼠按照随机数字表法随机分为7组，每组6只，正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）、地塞米松组（C组）、淫羊藿女贞子水提物组（D组）、地塞米松合淫羊藿女贞子水提物组（E组）、淫羊藿女贞子有效组分组（F组）、地塞米松合淫羊藿女贞子有效组分组（G组）。卵蛋白致敏并激发建立哮喘模型后给药，C、E、G组腹腔注射地塞米松注射液（0.5 mg/kg）；D及E组灌胃给予淫羊藿女贞子水提物（4∶3，0.35 g/kg生药）；F及G组灌胃给予淫羊藿女贞子有效组分（2∶3，100 mg/kg），均每日1次，共计2周。通过HE、Masson、PAS染色观察肺组织的病理改变，并测量胶原纤维增生情况、标准化总管壁厚度（Wat）、标准化平滑肌厚度（Wam）以及上皮组织标准化杯状细胞面积。 结果与B组比较，C、D、E、F、G组的Wat、Wam值、标准化胶原面积及标准化杯状细胞面积均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；与C组比较，E、F组对纤维增生有显著改善作用（P＜0.05），E、F、G组Wat显著降低（P＜0.05）。结论地塞米松合用淫羊藿女贞子水提物或有效组分对改善哮喘气道病理有一定的协同增效作用。

哮喘；淫羊藿；女贞子；地塞米松；实验研究；病理学

［Abstract］Objective To study the combined effects of the aqueous extracts and active ingredients from Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucid and Dexamethasone on the patho1ogica1 changes in the asthmatic rats.Methods 42 SD rats were random1y divided into 7 groups according to the random number tab1e method，each group had 6 rats，inc1uding norma1 contro1 group（group A），asthma mode1 group（group B），Dexamethasone group（group C），aqueous extracts group（group D），Dexamethasone p1us aqueous extracts group（group E），active ingredients group（group F）and Dexamethasone p1us active ingredients group（group G）.Asthmatic mode1 was dup1icated by ova1bumin through sensitizing and cha11enging in rats and give medicine，C，E，G group were administered Dexamethasone injection（0.5 mg/kg）；D and E group were gavaged with Herba Epimedii，Fructus Ligustri Lucid aqueous extract（4∶3，0.35 g/kg crude drug）；F and G group were gavaged Herba Epimedii，Fructus Ligustri Lucid effective components（2∶3，100 mg/kg），once a week，for a tota1 of two weeks.The patho1ogy changes in the bronchia1 1ung tissue of the asthmatic rats were detected through Masson staining，HE staining and PAS staining.And the co11agen fiber hyperp1asia，standardized tota1 bronchia1 wa11 area（Wat），standardized smooth musc1e area（Wam），and standardized epithe1ia1 gob1et ce11 area were measured. Results Compared with group B，group C，D，E，F and G cou1d reduce the co11agen area，Wat，Wam and standardized epithe1ia1 gob1et ce11 area（P＜0.05 or P＜0.01）. Compared with group C，group E and F cou1d improve fibrop1asias（P＜0.05），and group E，F and G cou1d reduce Wat（P＜0.05）.Conclusion The combination of Herba Epimedii，Fructus Ligustri Lucid and Dexamethasonein may p1ay a protective ro1e in airway patho1ogica1 changes of asthma rats.

［Key words］Asthma；Herba Epimedii；Fructus Ligustri Lucidi；Dexamethasonein；Experimenta1 study；Patho1ogy

支气管哮喘是一种气道慢性炎症性疾病［1］。糖皮质激素（g1ucocorticoids，GC）由于其强大的兔疫抑制和抗炎作用，是临床上治疗哮喘的首选药［2］，但应用过程中出现的激素依赖、激素抵抗以及局部和全身性副作用却难以避兔［3］。课题组前期研究发现，淫羊藿女贞子水煎剂合用布地奈德吸入可抑制哮喘大鼠气道炎症及重塑的病理改变［4］；合用地塞米松能增强后者的抗炎作用，并抑制其不良反应［5-7］。本研究以淫羊藿女贞子水提物及主要有效成分为研究对象，探讨与地塞米松合用对哮喘大鼠气道病理改变的影响，以期为中西药联合应用治疗哮喘，尤其是难治性哮喘提供实验依据。

1　材料与方法

1.1动物

雄性SPF级SD大鼠42只，月龄为（3±1）个月，体重（120±10）g，合格证号：SCXK（京）2012-0001，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。置于室温为（25±2）℃，湿度为（20±5）%，昼夜明暗交替时间为12 h∶12 h，自由饮水、进食的SPF级动物房内饲养。

1.2实验药物

淫羊藿水提物（批号：20130155）、女贞子水提物（批号：20130104），均由西安康威生物有限公司提供，提取率为1∶10。淫羊藿有效组分为总黄酮类，女贞子有效组分为总黄酮和齐墩果酸类。淫羊藿有效成分提取物：淫羊藿药材切碎，用90%乙醇提取3次，合并提取液，回收至无醇沉，用石油醚萃取3次（除去叶绿素），弃去石油醚部分，水部分上D-101大孔树脂，水洗到无色后，用90%乙醇洗脱，所得蒸干，即为淫羊藿总黄酮提取物。总黄酮含量以淫羊藿苷计为80%，主要包括淫羊藿苷，淫羊藿次苷Ⅰ，淫羊藿次苷Ⅱ，宝藿苷，朝藿定A、B、C等，提取率为2.5%。女贞子有效成分提取物：女贞子粉粹，75%乙醇加热提取3次，合并提取液，回收到无醇，上AB-8大孔树脂，水洗（除糖），弃去水液，再用75%乙醇冲洗，所得蒸干即为女贞子提取物。有效成分为总环烯醚萜和总黄酮类，含量分别以齐墩果酸和芦丁计总含量＞80%，主要包括特女贞苷，女贞苷，橄榄苦苷，木樨榄苷二甲酯，女贞酸，新女贞苷，女贞果苷A、B、C、D，芹菜素-7-O-葡萄糖苷等，提取率为5%。

1.3主要试剂与仪器

卵蛋白（美国Sigma公司，批号：A5253-100g），氢氧化铝凝胶（美国Sigma公司，批号：A8222-250mL），地塞米松磷酸钠注射液（5 mg/支，国药集团容生制药有限公司，批号：H41020036）；尼康（Nikon）ECLIPSE 80i生物显微镜及NIS-E1ements BR 3.2图像分析软件（北京锐驰恒业仪器科技有限公司）。

1.4造模及给药方法

SD大鼠随机分为正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）、地塞米松组（C组）、淫羊藿女贞子水提物组（D组）、地塞米松合淫羊藿女贞子水提物组（E组）、淫羊藿女贞子有效组分组（F组）、地塞米松合淫羊藿女贞子有效组分组（G组），每组6只。参考文献［8］，从第1天开始，除A组外，其余各组均造模。造模成功后，各造模组用1%的卵蛋白（OVA）氢氧化铝溶液雾化30 min，A组雾化生理盐水溶液，每周2次，直至实验结束。实验第22天开始给药，C、E、G组腹腔注射地塞米松注射液（0.5 mg/kg）；D及E组灌胃给予淫羊藿女贞子水提物（4∶3，0.35 g/kg生药）；F及G组灌胃给予淫羊藿女贞子有效组分（2∶3，100 mg/kg），均每日1次，共计2周。

1.5样本采集与检测

第36天麻醉处死动物。开胸，暴露心肺，快速取出肺组织连同气管，结扎左组织器官，剪下左肺。切成厚度约3 mm的组织块，置于10%的甲醛溶液内固定24 h。常规石蜡包埋，制片。参考文献［9］行HE染色及Masson染色，参考文献［10］行PAS染色，在光镜下进行观察。

1.6图像分析软件测量

［11］拍摄每个样本400倍光镜下的3个视野。通过测量Masson染色后的上皮组织细胞面积及胶原纤维面积，计算标准化胶原纤维面积（胶原纤维面积/上皮组织细胞面积）；通过测量HE染色后的图片，计算气管基底膜周径（Pbm）、标准化总管壁厚度（Wat）以及标准化平滑肌厚度（Wam）；通过测量PAS染色后的杯状细胞面积及Pbm值，计算单位长度基底膜上的平均杯状细胞面积（标准化杯状细胞面积）。

1.7统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较根据方差齐性检验结果选择LSD-t（方差齐）或Tamhane's T2（方差不齐）检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠胶原增生情况比较

与A组标准化胶原面积 ［（62.97±16.44）μm2/mm］比较，B组［（93.55±14.74）μm2/mm］大鼠胶原纤维增生明显（P＜0.01）；与B组比较，各给药组［C组：（59.79±9.91）μm2/mm，D组：（48.01±8.27）μm2/mm，E组：（44.07± 7.70）μm2/mm，F组：（43.81±9.76）μm2/mm，G组：（53.92± 12.96）μm2/mm］均明显抑制胶原纤维增生（均P＜0.01）；与C组比较，E组、F组能进一步抑制胶原纤维增生（P＜0.05）。见图1。

图1　各组大鼠病理Masson染色（400×）

2.2各组大鼠Wat和Wam值比较

肺组织HE染色计量结果显示：与A组比较，B 组Wat和Wam值均显著性升高（均P＜0.01）；经药物治疗后，与B组比较，5个给药组均能显著降低Wat及Wam值（P＜0.05或P＜0.01）；与C组比较，E组、F组和G组均能显著降低Wat值（P＜0.05）。见表1、图2。

表1　各组大鼠Wat、Wam值比较（μm2/μm，±s）

表1　各组大鼠Wat、Wam值比较（μm2/μm，±s）

注：与A组比较，**P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与C组比较，▲P＜0.05

组别　　只数　Wat　Wam A组B组C组D组E组F组G组6666666 45.84±14.93 87.48±8.38**72.66±7.39△64.68±10.82△△55.58±14.60△△▲58.78±9.01△△▲57.85±10.98△△▲17.39±5.14 46.91±8.95**21.88±6.11△△15.05±8.63△△15.25±5.47△△18.78±6.28△△16.26±5.26△△

图2　各组大鼠病理HE染色（400×）

2.3各组大鼠杯状细胞增生比较

与 A组标准化杯状细胞面积 ［（0.2548± 0.0665）μm2/mm2］比较，B组［（0.4067±0.0835）μm2/mm2］大鼠杯状细胞增生显著（P＜0.01）；与B组比较，5个给药组［C组：（0.2755±0.0634）μm2/mm2，D组：（0.2532± 0.0507）μm2/mm2，E组：（0.2255±0.0336）μm2/mm2，F组：（0.2686±0.0787）μm2/mm2，G组：（0.2337±0.0531）μm2/mm2］肺组织杯状细胞增生明显缓解（均P＜0.01）。见图3，封三。

3　讨论

哮喘是一种复杂的异质性慢性炎症性疾病，其特点是气道炎症和气道重构，包括杯状细胞和气道平滑肌细胞增生、黏液分泌过多和嗜酸性粒细胞浸润等［12］。GC是目前治疗哮喘的首选药物，但长期应用不可避兔产生局部或全身性副作用，甚至激素抵抗的发生，影响激素的抗炎作用。近年有研究发现，在GC应用的同时合用中药，可产生协同增效的抗炎作用，并维持GC作用的敏感性，预防激素抵抗的发生［13-14］。现代学者认为，外源性超生理剂量的GC类同于“壮火”，发越肾气、肾精，致火旺阴伤，日久累及肾阳，最终形成阴阳两亏［15-16］，防治GC的不良反应当以补肾中阴阳为基本立法。课题组前期研究发现，平补肾中阴阳的药对淫羊藿女贞子煎剂能够协同激素抗炎，并拮抗激素不良反应［17，5］。本研究以淫羊藿女贞子水提物及有效组分为研究对象，评价药物协同激素对哮喘大鼠气道炎症、气道重塑相关病理学改变的影响。

实验结果提示，哮喘模型大鼠Masson染色涂片中胶原纤维明显沉积，HE染色中Wat、Wam显著增高，PAS染色中上皮杯状细胞大量增生，表明哮喘模型出现以气管壁及平滑肌增厚、胶原纤维及杯状细胞增生为评价指标的气道炎症及气道重塑的病理改变。经过药物治疗后，5个治疗组均明显抑制胶原纤维沉积及杯状细胞的增生，降低Wam、Wat值，提示各给药组对哮喘气道炎症及气道重塑的病理改变有良好的疗效。且与单用地塞米松相比，合用中药水提物及有效成分均能降低Wat值，合用中药水提物对胶原纤维沉积的抑制显著。提示在激素地塞米松应用的同时，合用平补阴阳中药淫羊藿女贞子水提物或有效成分可产生一定程度的协同抗炎及抑制气道重塑的作用，为今后进一步研究中西医药结合治疗哮喘的作用机制提供了实验基础。

此外，值得注意的是，本研究发现淫羊藿女贞子提取物组对胶原纤维增生和Wat的作用优于地塞米松组。淫羊藿提取物主要为淫羊藿苷，文献报道有类激素样作用，能提高机体兔疫力，抗炎，从而减轻哮喘气道炎症，其作用与地塞米松类似［18-19］；女贞子提取物中的齐墩果酸等萜类，也具有明确的抗炎作用，对急慢性炎症均有明显抑制作用［20］。提示淫羊藿女贞子提取物具有的良好的抗炎作用可能是其对Wat改善作用的基础。虽然GC由于具有良好的抗炎作用而一直是治疗哮喘的首选药物，但其对于哮喘的典型病理改变——气道重塑的作用并不理想，而气道重塑是哮喘反复发作难以治愈的重要原因。课题组前期研究已证实，淫羊藿女贞子煎剂对哮喘大鼠气道重塑具有明显的改善作用［17］。在本次实验中采用的淫羊藿女贞子水提物及有效成分配伍研究中再次证实了其对胶原纤维的改善作用，尤其是有效成分配伍的作用优势，值得进一步展开研究，探讨其作用机制，以期为研发中药提供依据。

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Effects of combination of Herba Epimedii，Fructus Ligustri Lucid and Dexamethasone on the pathological changes in asthmatic rats

TANG Xiufeng1NIAN Honglei1YANG Yan1XU Liping1WANG Xiujuan1LIU Renhui1，2
1.Schoo1 of Traditiona1 Chinese Medicine，Capita1 Medica1 University，Beijing100069，China；2.Beijing Key Laboratory of Traditiona1 Chinese Medicine Co11atera1 Disease Theory Research，Beijing100069，China

R285.5；R256.12

A

1673-7210（2016）04（c）-0004-04

国家自然科学基金资助项目（81373814）；北京中医药薪火传承“3+3”工程二室一站建设项目（2012-SZ-C-42）；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目（CIT& TCD201504097）。

唐秀凤（1992-），女，山东莱芜人，首都医科大学2015级中医药学院中药学专业在读硕士研究生；研究方向：中药及复方的药效及作用机制。

刘仁慧（1974-），女，山东烟台人，医学博士，副教授，硕士生导师；研究方向：中药及复方的药效及作用机制。

2016-01-21本文编辑：程 铭）