刘显威，刘淑集，张学勤，肖美添，，吴靖娜，许旻，刘智禹

(1. 福建省水产研究所，国家海水鱼类加工技术研发分中心(厦门)，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门361013；2.福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建 厦门 361013；3. 华侨大学化工学院，福建 厦门361021)



响应面法优化鱿鱼墨黑色素的制备工艺

刘显威1,2,3，刘淑集1,2，张学勤3，肖美添3，1,2，吴靖娜1,2，许旻1,2，刘智禹1,2

(1. 福建省水产研究所，国家海水鱼类加工技术研发分中心(厦门)，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门361013；2.福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建 厦门 361013；3. 华侨大学化工学院，福建 厦门361021)

摘要：为了研究鱿鱼墨黑色素提取的最佳工艺条件，根据黑色素特有的性质，采用碱溶酸沉法从鱿鱼墨囊中提取鱿鱼墨黑色素，在考察NaOH浓度、碱提液料比、碱提温度、碱提时间、酸沉pH值5个单因素试验的基础上，选择NaOH浓度、碱提液料比、酸沉pH值为自变量，以鱿鱼墨黑色素的提取率为响应值，利用Design-Expert软件中的Box-Behnken中心组合设计方法设计3因素3水平试验方案，通过响应面分析，建立数学模型，确定鱿鱼墨黑色素的最佳提取工艺条件是：NaOH浓度为1.18 mol·L-1、碱提液料比为17 ∶1、酸沉pH值为1.85，在此条件下鱿鱼墨黑色素提取率的理论值16.72 %，验证实测平均值为16.69 %.通过红外光谱图分析结果表明鱿鱼墨黑色素在3 400 cm-1和1 600 cm-1处有黑色素特有的吸收峰，并且含有羟基、氨基及芳香环等结构.

关键词：鱿鱼墨黑色素； 提取率； 响应面分析法

鱿鱼(Squid)学名枪乌贼[Lolig chinensis(Gray,1849)]，是软体动物门(Mollusca)头足纲(Cephalopoda)枪形目(Teuthoidea)枪乌贼科(Loliginidae)的统称[1].鱿鱼因其味极鲜美，高蛋白、低脂肪，富含人体必需的氨基酸而倍受人们喜爱，有着“穷人的鲍鱼”的美称[2-4].近年来，我国鱿鱼产量已跃居世界前列，2014年我国鱿鱼年产量已达到125.32万t，鱿鱼捕捞已成为我国海洋渔业的重要组成部分[5].我国的鱿鱼捕捞品种以阿根廷滑柔鱼、太平洋褶柔鱼和秘鲁鱿鱼3种鱿鱼为主，这3种鱿鱼也是我国鱿鱼加工产业的主要原料[6].目前，鱿鱼的加工主要是利用其胴体，加工产品较为多样，如冷藏制品、干制品、鱿鱼丝、即食鱿鱼等[7]，但加工过程中所产生的副产物大部分被抛弃或加工成低值饲料，造成了极大的资源浪费和环境污染.鱿鱼加工副产物中墨囊约占鱿鱼体重的1.3 %[8]，墨囊中的鱿鱼墨是由黑色粒状物组成的高密度混悬液，黑色粒状物分为内外两层，鱿鱼墨黑色素就存在于内核中[9].鱿鱼墨黑色素具有清除自由基、防紫外线辐射、鳌合重金属离子等功能[10-11]，在日用轻工业、食品加工工业、医药化工、农业等众多领域应用广泛[12-14].

鱿鱼墨黑色素的提取方法目前主要有高速离心法、酸/碱水解法、酶解法.高速离心法操作虽然简单，但只能去除墨汁中的水溶性杂质，不溶于水的杂质仍还未被除去，所制备得到的黑色素制品的纯度仍不高[15].酸/碱水解法主要是利用在酸性或碱性条件下蛋白质被水解为小分子氨基酸，或使脂肪从组织里游离出来，从而分离黑色素.此方法制备的黑色素虽然纯度较高，但酸/碱法水解过程过于剧烈，会损伤黑色素的颗粒，不利于黑色素的完整性[16].Liu Yong等[17]的研究表明，强酸水解黑色素会导致其脱除羧基，而且容易使黑色素结合蛋白转变成类似色素物；强碱处理会导致黑色素的形态发生变化.酶解法制备黑色素的优点在于酶解条件温和，不会破坏黑色素的结构及表面形态，但酶解法无法去除黑色素中其他不被酶解的杂质[18].因此本文利用黑色素在碱性条件下可溶解而在酸性条件下会沉淀的特有性质来提取鱿鱼墨黑色素，此方法所制得的黑色素纯度较高，而且黑色素结构和表面形态都未被破坏.在考察鱿鱼墨黑色素制备的单因素试验基础上，利用响应面实验设计软件Design Expert version 8.0中的Box-Behnken模式对各主要影响因素之间的单一和交互作用等进行了研究，优化了鱿鱼墨黑色素的制备工艺，得出最佳的制备工艺参数，这为从鱿鱼墨囊中提取鱿鱼墨黑色素的工业化利用提供了理论基础.

1材料与方法

1.1材料与仪器材料：鱿鱼墨囊，由莆田市汇丰食品工业有限公司提供.

主要试剂：鱿鱼墨黑色素标准品为生化试剂，Sigma-Aldrich公司；氢氧化钠、盐酸等化学试剂均为分析纯.

主要仪器：离心机(5804R)，北京博仪恒业科技发展有限公司；电热恒温水槽(SSW-600-2S)，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；真空冷冻干燥机(SCIENTZ-10N)，宁波新芝生物科技股份有限公司；pH计(FE-20)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；傅立叶变换红外光谱仪(AVATAR370)，美国Thermo 公司.

1.2试验方法

1.2.1鱿鱼墨黑色素的制备工艺鱿鱼墨囊常温解冻，5倍体积水浸泡，10 000 r·min-1离心15 min，弃上清液保留沉淀，沉淀真空冷冻干燥，然后称取沉淀，按一定液料比加入一定浓度的NaOH溶液，放置在一定温度的水浴锅中浸提一段时间后，离心，取上清液，用6.00 mol·L-1HCl溶液调pH至一定值，静置后，10 000 r·min-1离心15 min，取沉淀水洗3次，将沉淀于真空中冷冻干燥，计算提取率(extraction rate, ER).

1.2.2单因素试验以鱿鱼墨黑色素提取率为指标，分别考察NaOH浓度、碱提液料比、碱提温度、碱提时间、酸沉pH值对提取率的影响.

1.2.3响应面法优化分析根据响应面实验设计软件Design Expert version 8.0中的Box-Behnken中心组合设计原理，利用SPSS软件对单因素试验结果进行数据统计分析，选取差异较为显著的3因素，即NaOH浓度、碱提液料比、酸沉pH值进行3因素3水平的响应面分析，优化鱿鱼墨黑色素的制备工艺.以鱿鱼墨黑色素的提取率为响应值(Y)，以NaOH浓度(X1)、碱提液料比(X2)和酸沉pH值(X3)为自变量 ，每一个自变量的试验水平分别以-1，0，1进行编码(见表1).

表1　Box-Behnken试验设计因素及水平

1.2.4鱿鱼墨黑色素的红外光谱表征分别称取约0.1 g KBr固体和0.01 g鱿鱼墨黑色素置于研钵中，充分研磨后，放在红外灯下干燥10 min，通过制样器压成圆形半透明的片状物质，并将其放入红外光谱仪中检测.

2结果与讨论

2.1碱溶酸沉法制备鱿鱼墨黑色素的单因素试验结果

2.1.1NaOH浓度对鱿鱼墨黑色素制备的影响固定碱提液料比为20 ∶1，碱提温度为60 ℃，碱提时间为2 h，离心，取上清液调节pH值为1.50，考察NaOH浓度对鱿鱼墨黑色素提取率的影响，结果如图1.

由图1可知，随着NaOH浓度的增加，鱿鱼墨黑色素的提取率先升高后降低，NaOH浓度为1.00 mol·L-1时鱿鱼墨黑色素的提取率最大.随着NaOH浓度的增加，一些碱溶性杂质溶解量会增加，这会影响鱿鱼墨黑色素在酸沉过程的析出，导致鱿鱼墨黑色素提取率的降低.因此，选择NaOH浓度为1.00 mol·L-1来进行试验优化.

2.1.2碱提液料比对鱿鱼墨黑色素制备的影响固定NaOH浓度为1.00 mol·L-1，碱提温度为60 ℃，碱提时间为2 h，离心后取上清液，调节pH值为1.50，考察碱提液料比对鱿鱼墨黑色素提取率的影响，结果见图2.

由图2可知，随着液料比的增加，鱿鱼墨黑色素的提取率先升高后降低，这是因为随着液料比的增加，内外鱿鱼墨黑色素浓度差就增大，传质推动力就增大，有利于鱿鱼墨黑色素溶解在碱溶液中，当液料比达到20 ∶1时鱿鱼墨黑色素的提取率最大.之后，随着液料比的增加鱿鱼墨黑色素的提取率在逐渐降低，这可能是因为随着液料比的增加，鱿鱼墨中其他碱溶性杂质的溶解也在增加，致使墨黑色素被杂质包裹，导致墨黑色素在酸沉过程中沉淀量减少，提取率降低.因此，选碱提液料比20 ∶1来进行试验优化.

2.1.3碱提温度对鱿鱼墨黑色素制备的影响固定NaOH浓度为1.00 mol·L-1，碱提液料比20 ∶1，碱提时间为2 h，离心后取上清液，调节pH值为1.50，考察碱提温度对鱿鱼墨黑色素制备的影响，结果如图3.

根据传质系数方程可知，温度的升高可以增大分子扩散系数，减小固体表面滞流层厚度，从而有利于提取率的提高.但是温度升高时不仅目标产物的提取率在增加，同时可溶于提取剂的杂质量也在增加[19].由图3可得，随着碱提温度的升高，鱿鱼墨黑色素的提取率先升高后降低，温度为40 ℃时鱿鱼墨黑色素的提取率最大.这可能是因为在碱提过程中，温度升高会使蛋白质、脂质和碳水化合物等杂质增多，提取液的粘度增大，从而导致鱿鱼墨黑色素的提取速率减慢之缘故.同时温度的升高也可能破坏鱿鱼墨黑色素的结构，造成鱿鱼墨黑色素的提取率降低.因此，选择40 ℃为碱提温度.

2.1.4碱提时间对鱿鱼墨黑色素制备的影响固定NaOH浓度为1.00 mol·L-1，碱提液料比为20 ∶1，碱提温度为60 ℃，离心后取上清，液调节pH值为1.50，考察碱提时间对鱿鱼墨黑色素制备的影响，结果见图4.

由图4可得，随着碱提时间的增加鱿鱼墨黑色素的提取率先升高后降低，碱提时间为1 h时提取率最大.之后随着碱提时间的增加，鱿鱼墨黑色素提取率虽然有所降低，但是其降低幅度较小.因此，选择1 h为碱提时间.

2.1.5酸沉pH值对鱿鱼墨黑色素制备的影响固定NaOH浓度为1.00 mol·L-1，碱提液料比为20 ∶1，碱提温度为60 ℃，碱提时间为2 h，考察酸沉pH值对鱿鱼墨黑色素制备的影响，结果见图5.

由图5可知，随着酸沉pH值的增加，鱿鱼墨黑色素的提取率先升高后降低.在酸沉pH=2.00的时候鱿鱼墨黑色素的得率最大.这可能是因为黑色素含有—COOH和—NH2结构[20]，与蛋白质同样为两性电解质，在pH值为2.00时为黑色素的等电位点，此时黑色素分子以两性离子形式存在，净电荷为零，黑色素分子在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，在等电点时黑色素溶解度最小，最易形成沉淀物.因此在pH值为2.00时鱿鱼墨黑色素的提取率最大，故选择酸沉pH=2.00来进行试验优化.

2.2 响应面分析及试验结果

2.2.1响应面分析方案及结果在单因素试验的基础上，选取NaOH浓度、碱提液料比、酸沉pH值进行3因素3水平的响应面分析，试验方案及结果见表2.

表2　响应面分析方案及试验结果

利用Design-expert软件对表2中的数据进行二次回归拟合，得到回归方程：

对所得的模型及方程系数进行显著性分析，结果见表3.从回归方程可知，各变量对提取率Y的影响顺序依次为：酸沉pH值(X3)>NaOH浓度(X1)>碱提液料比(X2)，并且用上述方程来描述各因素和响应值之间的关系时，其因变量和全部自变量之间的线性关系十分显著(r=1.96/1.97=0.99)，并且模型的R2值为0.994 7，非常接近1，说明通过二次回归得到的鱿鱼墨黑色素提取率的模型和实验拟合较好，并且方程的失拟项不显著，表明方程实验误差小.

表3　响应面ANOVA方差分析

注：“**”表示P< 0.01，差异极显著；“*”表示P< 0.05，差异显著.

表4　模型分析

表4的数据表明，模型预测R2=0.994 7，校准系数为0.987 8，说明此模型能解释98.78%的试验结果.离散系数为0.83%说明模型能较好地反应各因素与鱿鱼墨黑色素提取率之间的真实试验值，试验的可靠性高.回归方程各项的方差分析结果还表明，各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系.根据数据分析进行回归分析，并作出响应面图和等值线图，分别见图6—8.

由图6—8可知，NaOH浓度和碱提液料比、碱提液料比和酸沉pH值的交互作用对鱿鱼墨黑色素的提取率影响较显著，其等高线呈椭圆形，响应面均为开口向下的凸形曲线，并且有极值最高点.而NaOH浓度和酸沉pH值等高线图呈圆形，其交互作用对鱿鱼墨黑色素的提取率影响不显著.

2.2.2优化条件验证因此上述回归方程即可确定鱿鱼墨黑色素的最佳提取条件.对回归方程取一阶偏导数等于零，解得方程X1=1.18，X2=16.87，X3=1.85，即提取鱿鱼墨黑色素的最佳条件为：NaOH浓度为1.18 mol·L-1、碱提液料比为16.87 ∶1、酸沉pH值为1.85.为方便实际生产，现将鱿鱼墨黑色素制备条件优化：NaOH浓度为1.18 mol·L-1、碱提液料比为17∶1、酸沉pH值为1.85.在此条件下，鱿鱼墨黑色素的提取率理论值可以达到16.72%.

为了验证分析结果的可靠真实性，采用上述工艺条件进行实验验证，三次平行实验所测得的提取率为16.69%、16.68%、16.70%，接近理论数据.因此，响应面所得的最优工艺参数准确可靠，具有实际意义.

2.3鱿鱼墨黑色素的红外光谱图将制备的鱿鱼墨黑色素进行红外光谱扫描，以鱿鱼墨黑色素标准品为对照，结果如图9所示.由图9可知，两者在3 300～3 500 cm-1处都有强吸收，表明鱿鱼墨黑色素含有羟基或氨基结构；两者在1 651 cm-1和1 515 cm-1处为芳香环骨架的伸缩振动和CHCH平面振动所产生的峰.Liu Y 等[22]的研究表明，黑色素的红外光谱在3 μm与6 μm处有特征吸收峰，Mbonyiryivuze[23]和Xin C[24]的研究同样表明了黑色素的红外光谱在相同位置有特征吸收峰，因此，可以初步推测所提取的物质为鱿鱼墨黑色素.

3结论

本实验利用黑色素特有性质提取鱿鱼墨黑色素，通过对单因素试验的考察确定了NaOH浓度为1.00 mol·L-1、碱提液料比为20 ∶1(mL/g)、碱提温度为 40 ℃、碱提时间为1 h、酸沉pH 值为2.0的单因素条件，然后选取了NaOH浓度、碱提液料比、酸沉pH值3个因素，进行3因素3水平的响应面试验，经过分析拟合得出可靠的数学模型二次回归方程为：

通过对回归方程的拟合及实际生产条件的优化，得出鱿鱼墨黑色素提取的最适工艺参数为：NaOH浓度为1.18 mol·L-1、碱提液料比为17 ∶1、酸沉pH值为1.85.在此条件下鱿鱼墨黑色素的得率为16.69 %.采用红外光谱对制备的鱿鱼墨黑色素进行分析，结果表明：所制备的鱿鱼墨黑色素含有羟基、氨基及芳香环结构等，与鱿鱼墨黑色素标准品的结构类似.

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Optimization of Melanin Preparation Conditions from Squid Ink by Response Surface Methodology

Liu Xianwei1,2,3， Liu Shuji1,2， Zhang Xueqin3， Xiao Meitian3，Cai Shuilin1,2， Wu Jingna1,2， Xu Min1,2， Liu Zhiyu1,2

(1.National Research and Development Center for Marine Fish Processing (Xiamen), Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province, Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China;2. Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen 361013, China;e of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

Abstract：To obtain the optimization extraction technology condition of squid ink melanin, based on the peculiar nature of melanin, the alkali-solution and acid-isolation method was used to extract melanin from squid ink. After performing the five single-factor tests, which was NaOH concentration, liquid-to-solid ratio, extraction time, extraction temperature, and pH, respectively, NaOH concentration, liquid-to-solid ratio, and pH were used as independent variable. The extraction rate of squid ink melanin was used as an index, and the mathematical regression model was established by Box-Behnken center-united design and response surface methodology (RSM). The RSM results showed that the optimal extraction processing parameters were determined as follows: NaOH concentration, 1.18 mol·L-1; liquid-to-solid ratio, 17:1(mL·g-1); pH, 1.85. Under these conditions, the extraction rate of theoretical value was 16.72 %. The average experimental value after validation was 16.69 %. The analysis result of IR spectrum indicated that there were two characteristic absorption peaks at 3400 cm-1and 1600 cm-1, respectively, which suggested that the extracted melanin contained the structure of hydroxyl, amino, and aromatic.

Keywords：squid ink melanin; extraction rate; response surface methodology

收稿日期：2015-12-07

基金项目：国家海洋公益专项(201305015)；厦门市海洋经济发展专项 (14CZP041HJ15)

作者简介：刘显威(1991-)，男，安徽淮南人，华侨大学化工学院2012级硕士研究生，E-mail:wynlxw@sina.com 通信作者： 刘智禹(1972-)，男，福建莆田人，高级工程师，研究方向：水产品加工与综合利用，E-mail:13906008638@163.com

文章编号：1004-1729(2016)01-0025-08

中图分类号：TS 254.9

文献标志码：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0005