人工饲料对苹果蠹蛾颗粒体病毒产量的影响

2016-07-14刘国锋樊江斌吴正伟梁召俊

西北农业学报 2016年7期

关键词：单头苹果蠹蛾幼虫

刘国锋，樊江斌，吴正伟，梁召俊，王　敦

(西北农林科技大学植保资源与利用教育部重点实验室，陕西杨凌　712100)

人工饲料对苹果蠹蛾颗粒体病毒产量的影响

刘国锋，樊江斌，吴正伟，梁召俊，王敦

(西北农林科技大学植保资源与利用教育部重点实验室，陕西杨凌712100)

优化增殖苹果蠹蛾颗粒体病毒张掖株(CypoGV-ZY)的饲料配方，为实现经济高效的病毒生产奠定技术基础。采用喂毒法，研究苹果蠹蛾人工饲料中苹果粉、酵母、小麦面粉、玉米粉4种主要营养成分不同配比对苹果蠹蛾幼虫生长及对CypoGV产量的影响。结果表明:添加酵母的饲料配方，幼虫体质量和病毒产量均显著提高；其中取食C配方饲料的染毒幼虫，病毒产量最高，单头死亡幼虫虫尸质量、单头幼虫产毒量及每克虫尸产毒量分别可达30.57 mg、8.63×109和28.25×1010g-1；用玉米粉取代该配方中的小麦面粉时，染毒幼虫的虫尸质量明显降低，病毒产量显著下降。可见，以酵母和小麦面粉作为主要营养成分的C配方饲料，能显著提高病毒的产量，最适于病毒增殖生产。

苹果蠹蛾颗粒体病毒；人工饲料；病毒产量

苹果蠹蛾(CydiapomonellaL.)属鳞翅目(Lepidoptera)卷蛾科(Tortricidae)，是全球范围内最具破坏性的果树害虫，主要为害苹果树和梨树等[1-2]。幼虫钻蛀果实内部取食，排出果外的粪便带来微生物污染，给苹果产业造成严重的经济损失。苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydiapomonellagranulovirus，CypoGV)首次分离自墨西哥[3]。CypoGV对苹果蠹蛾具有专一性和高致病性，已经大面积推广应用于苹果蠹蛾的生物防治[4-5]。由于长期单一使用墨西哥CypoGV分离株防治苹果蠹蛾，2004年德国[6]和法国[7]的有机苹果园中出现对CypoGV抗性的种群。目前，苹果蠹蛾对CypoGV的抗性发展已经遍布欧洲[8]，为了克服抗性，需要病毒新分离株及新的变种[9]，包括俄罗斯、英国、格鲁吉亚、伊朗、加拿大、新西兰、意大利、瑞士都陆续报道分离出CypoGV毒株[10-13]。中国对CypoGV的研究虽然起步较晚，但也相继分离获得CypoGV-ZY、CypoGV-CJ01、CypoGV-KS1和CypoGV-KS2等毒株[14-15]。其中CypoGV-ZY(张掖株)病毒杀虫制剂具有较好的杀虫效果，已于2013年获得国家发明专利(专利号201010013631.9)。在中国，随着苹果蠹蛾东移的威胁[16]，CypoGV制剂具有很大的应用潜力，大规模生产CypoGV制剂迫在眉睫。虽然，不同人工饲料对苹果蠹蛾发育的影响已有报道[17]，但这些饲料成分对CypoGV-ZY产量的影响尚未见报道。为此，本试验改进和优化已经报道的人工饲料配方，探讨几种营养成分的配比对CypoGV产量的影响，确定病毒增殖的最佳配方以实现高效生产CypoGV，为CypoGV本土株的大规模人工增殖提供依据。

1材料与方法

1.1试虫及病毒来源

试验用虫采集于新疆喀什市和阿拉尔市苹果园，在甘肃农业大学草业学院实验室密闭饲养。幼虫单独放到无菌1.5 mL离心管内，用半人工饲料于人工气候箱内饲养，作为供试虫源。饲养条件为：温度(25±0.5) ℃，光周期16L∶8D，光照度600 lx，相对湿度(60±7)%。

苹果蠹蛾颗粒体病毒张掖株(CypoGV-ZY)于2005年由西北农林科技大学分子病毒学实验室分离自甘肃张掖。CypoGV-ZY在甘肃兰州扩繁并纯化，将病毒颗粒(occlusion bodies,OBs)初纯化后，配制成1×1012mL-1(每毫升液体所含病毒颗粒个数)的病毒悬液，储存于4 ℃备用。

1.2饲料配方

5种人工饲料(表1)参考Hansen等[18]的饲料配方及配制方法。A、B、C饲料配方改进和优化自樊江斌等[17]的研究：C配方饲料中的酵母分别被苹果粉半数或全部替换制成配方B、A。用玉米粉半数或全部替换C配方饲料中的小麦面粉制成配方D、E。

表1　5种苹果蠹蛾人工饲料配方

1.3幼虫饲养

幼虫使用1.5 mL离心管单头饲养，分别用5种人工饲料饲养初孵幼虫至5龄初，每种饲料随机挑选30管，统计幼虫存活率并称量，饥饿24 h，备用，每处理重复3次。

1.4病毒感染

将5种饲料均匀切成边长2 mm的饲料块，放置于无菌的1.5 mL离心管中，用移液器吸取1×106mL-1的病毒悬液，每块饲料滴5 μL毒液，晾干。每种饲料块接入与之对应饥饿后的5龄幼虫，及时塞上已灭菌棉塞，让其取食感染。1 d后，待有毒饲料块取食完全，补充无毒新鲜饲料。喂毒后每隔12 h观察各处理幼虫感染和死亡情况，并记录。每处理30头5龄幼虫，重复3次。饲养条件同“1.1”。

1.5死虫收集及病毒悬液制备

感病幼虫死亡当日用适量蒸馏水清洗，称量其体质量。病死虫用研磨器研成匀浆，稀释后，用3层纱布过滤，滤液150 g离心3 min，收集上清，再10 000 g离心30 min富集病毒颗粒，用1 mL无菌水重悬浮，重离心悬浮1次，得到病毒悬液，4 ℃保存。

1.6病毒产量测定

将“1.5”制备的病毒悬液定容稀释，血球计数板计数测得病毒数量。根据稀释倍数、定容体积和死虫质量计算单头幼虫及每克虫尸病毒产量。

1.7数据统计与分析

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计分析，应用GraphPad Prism 5软件作图。

2结果与分析

2.1不同饲料对幼虫生长的影响

图1、2表明，不同配方饲料对幼虫生长影响显著(P<0.05)。幼虫取食B、C、D配方饲料时幼虫存活率，显著高于E、A配方饲料；幼虫取食C、D配方饲料时幼虫平均体质量显著高于其他饲料。虽然幼虫取食B、C、D、E 4种配方饲料，在幼虫存活率和平均体质量方面有差异，但均在较高水平，大部分个体可正常化蛹；而幼虫取食A饲料，幼虫生长不良，存活率和幼虫体质量显著降低，仅有少数个体化蛹，不适于苹果蠹蛾饲养。

2.2不同饲料对病毒产量的影响

测定取食A、B、C、D、E 5种不同的人工饲料时苹果蠹蛾单头幼虫及每克虫尸的病毒产量。由表2可知，不同饲料对单头幼虫病毒产量及每克虫尸病毒产量的影响有显著差异(P<0.05)。对于单头幼虫病毒产量，C配方显著高于另外4种配方；B、E之间没有显著差异，但显著高于A、D；A配方对应的病毒产量最低。计算每克虫尸病毒产量表明： C>B>E>D>A，除了B、C在0.01水平差异不显著外，其他配方之间均差异显著。

柱状图上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters above the bars represent significant difference (P<0.05),the same hereinafter.

图1取食5种配方饲料的苹果蠹蛾从初孵到5龄累计存活率

Fig.1Cumulative survival rate ofC.pomonellafrom hatching to fifth-instar for five artificial diets

图2　取食5种配方饲料的苹果蠹蛾5龄幼虫体质量

饲料种类Foragespecies颗粒体产量 Yieldofviruses单头幼虫产量(×109)Averageperlarva每克虫尸产量(×1010)/g-1AveragedeadlarvaA0.82±0.01dD4.53±0.23eDB6.85±0.20bB27.85±0.11bAC8.63±0.15aA28.25±0.12aAD5.86±0.10cC20.71±0.07dCE6.55±0.18bB24.41±0.12cB

注：数据为“平均数±标准差”。同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note: Data are “mean±standard deviation”.Data followed by different lowercase letters within same column are significant difference (P<0.05),different capital letters are extremely significant difference(P<0.01).

2.3不同饲料对虫尸质量的影响

取食5种配方饲料的苹果蠹蛾分别于5龄时喂食5 μL 1×106mL-1CypoGV-ZY的病毒悬液，收集病死虫尸并称量。方差分析表明，不同配方饲料对单头虫尸体质量的影响显著(P<0.05)(图3)。从图中可以看出，以C配方饲料为食的染毒幼虫病死后虫尸体质量最高，可达30.57 mg，其次是D、E，之后依次为B、A。

图3　取食5种配方饲料的苹果蠹蛾染毒

3结论与讨论

病毒的大量繁殖是病毒微生物杀虫剂生产和应用的前提，虽然CypoGV可用昆虫细胞繁殖[19]，但病毒产量低、成本昂贵，因此CypoGV生产仍使用活体幼虫增殖，但由于不同的人工饲料直接影响苹果蠹蛾的生长发育，从而影响病毒产量。本研究在前人对苹果蠹蛾人工饲料研究的基础上，探讨几种人工饲料对CypoGV-ZY产量的影响。应用以小麦面粉和酵母为主要营养成分的C配方饲料，单头幼虫病毒产量和每克虫尸产毒量都显著高于其他4种配方饲料。据此认为，幼虫取食C配方饲料最适宜CypoGV增殖。不同的营养组合对昆虫病毒的产量有明显影响，用酵母替代苹果粉能够促进幼虫生长发育，显著提高幼虫体质量，增加营养，利于CypoGV增殖。Witzgall等[20]发现浸过酵母发酵液的苹果饲喂苹果蠹蛾幼虫能够促进其生长发育；樊江斌等[17]研究认为添加酵母的饲料可以增加虫质量。酵母是重要的氮源，Shapiro[21]报道大蜡螟(Galleriamellonella)取食含氮丰富的饲料易感染核多角体病毒；吕鸿声[22]也报道取食氮物质较多的嫩桑叶的家蚕(Bombyxmori)感染NPV的百分率比取食适熟桑叶的高一倍。本研究也有类似结论，在饲料中添加酵母，可以提高幼虫体质量、显著提高病毒产量。

玉米作为人工饲料的营养物质已应用于多种昆虫的饲养[23-24]，但作为苹果蠹蛾饲料成分，研究的却很少。本试验发现含玉米的饲料也可以用于苹果蠹蛾饲养和CypoGV-ZY的增殖，但病毒产量不如C(纯小麦面粉)配方饲料。相对于小麦面粉，玉米粉不适于苹果蠹蛾幼虫的生长发育，幼虫体质量降低，但能在一定程度上提高苹果蠹蛾对病毒的敏感性，当小麦面粉完全被玉米粉取代，单位质量虫体病毒产量比D配方饲料(玉米粉与小麦面粉质量比为1∶1)明显回升，这可能是由于添加玉米在营养成分方面的变化，降低幼虫对病毒的抵抗力，利于病毒的侵染、繁殖。

影响病毒产量的因素有许多，虫体质量是重要因素，不同饲料可以通过影响幼虫发育影响病毒产量。幼虫取食A饲料，影响生长发育，显著降低病毒产量。这与Howell[25]使用苹果粉的饲料，幼虫生长发育良好的结果有差异，其原因有待进一步研究。环境对病毒产量也有很大的影响，但这仍需进一步研究。中国苹果蠹蛾人工饲料配方虽然已经有一些报道，但与国外产业化大量饲养苹果蠹蛾相比差距很大，仍在优化改进阶段，本试验也只分析了几种主要营养成分对CypoGV-ZY产量的影响，要获得可以产业化生产病毒的饲养配方和技术，尚需对其他因子做进一步系统研究。

Reference：

[1] WILLETT M J,NEVEN L,MILLER C E.The occurrence of codling moth in low latitude countries:validation of pest distribution reports[J].HortTechnology,2009,19(3):633-637.

[2]WITZGALL P,STELINSKI L,GUT L,etal.Codling moth management and chemical ecology[J].AnnualReviewofEntomology,2008,53(1):503-522.

[3]TANADA Y.A granulosis virus of the codling moth,Carpocapsaepomonella(Linnaeus)(Olethreutidae,Lepidoptera)[J].JournalInsectPathology,1964,6:378-380.

[4]ARTHURS S P,LACEY L A.Field evaluation of commercial formulations of the codling moth granulovirus:persistence of activity and success of seasonal applications against natural infestations of codling moth in Pacific Northwest apple orchards[J].BiologicalControl,2004,31(3):388-397.

[5]LACEY L A,THOMSONB D,VINCENT C,etal.Codling moth granulovirus:a comprehensive review[J].BiocontrolScienceandTechnology,2008,18(7):639-663.

[6]FRITSCH E,UNDORF-SPAN K,KIENLE J,etal.Codling moth granulovirus:variations in the susceptibility of local codling moth populations[C].Weinsburg Germany:12thInternational Conference on Cultivation Technique and Phytopathological Problems in Organic Fruit-Growing Proceedings of the Conference,2006:7-13.

[7]SAUPHANOR B,BERLING M,TOUBON J F,etal.Carpocapse des pommes:Cas de résistance au virus de la granulose en vergers biologiques [J].Phytoma-LaDéfensedesvégétaux,2006,590:24-27.

[8]SCHMITT A,BISUTTI I L,LADURNER E,etal.The occurrence and distribution of resistance of codling moth toCydiapomonellagranulovirus in Europe[J].JournalofAppliedEntomology,2013,137(9):641-649.

[9]BERLING M,BLACHERE-LOPEZ C,SOUBABERE O,etal.Cydiapomonellagranulovirus genotypes overcome virus resistance in the codling moth and improve virus efficiency by selection against resistant hosts[J].AppliedandEnviromentalMicrobiology,2009,75(4):925-930.

[10]CROOK N E,SPENCER R A,PAYNE C C,etal.Variation inCydiapomonellagranulosis virus isolates and physical maps of the DNA from three variants[J].JournalofGeneralVirology,1985,66(11):2423-2430.

[11]EBERLE K E,SAYED S,REZAPANAH M,etal.Diversity and evolution of theCydiapomonellagranulovirus[J].JournalofGeneralVirology,2009,90(3):662-671.

[12]HARVEY J P,VOLKMAN L E.Biochemical and biological variation ofCydiapomonella(codling moth) granulosis virus[J].Virology,1983,124(1):21-34.

[13]REZAPANAH M,SHOJAI-ESTABRAGH S,HUBER J,etal.Molecular and biological characterization of new isolates ofCydiapomonellagranulovirus from Iran[J].JournalofPestScience,2008,81(4):187-191.

[14]甘恩宇,李晓峰,于欢,等.3株苹果蠹蛾颗粒体病毒本土株的毒力测定与田间防效[J].西北农林科技大学(自然科学版),2011,39(10):119-122.

GAN E Y,LI X F,YU H,etal.Virulence determination for three nativeCydiapomonellagranulovirus strains and their control effect in field[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2011,39(10):119-122(in Chinese with English abstract).

[15]申建茹,刘万学,万方浩,等.苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV-CJ01的分离和鉴定[J].应用昆虫学报,2012,49(1):96-103.

SHEN J R,LIU W X,WAN F H,etal.Characterization of theCydiapomonellagranulovirus CpGV-CJ01 from northwest China[J].ChineseJournalofAppliedEntomology,2012,49(1):96-103(in Chinese with English abstract).

[16]梁亮,余慧,刘星月,等.苹果蠹蛾在中国的适应性分析[J].植物保护,2010,36(4):101-105.

LIANG L,YU H,LIU X Y,etal.Analysis of suitability of the codling moth,Cydiapomonellain China[J].PlantProtection,2010,36(4):101-105(in Chinese with English abstract).

[17]樊江斌,吴正伟,尚素琴,等.苹果蠹蛾半人工饲料与饲养温度的优化[J].植物保护学报,2015,42(1):45-50.

FAN J B,WU ZH W,SHANG S Q,etal.Optimization of semi-artificial diet and temperature for rearing the codling mothCydiapomonella(L.)[J].JournalofPlantProtection,2015,42(1):45-50(in Chinese with English abstract).

[18]HANSEN J D,ANDERSON P A.Mass rearing codling moths:improvements and modifications[J].JournaloftheEntomologySocietyofBritishColumbia,2006,103:33-36.

[19]NASER W L,MILTENBURGER J P,HARVEY J P,etal.In vitro replication of theCydiapomonella(Codling Moth) granulosis virus[J].FEMSMicrobiologyLetters,1984,24:117-121.

[20]WITZGALL P,PROFFIT M,ROZPEDOWSKA E,etal.This is not an apple-yeast mutualism in codling moth[J].JournalofChemicalEcology,2012,38(8):949-957.

[21]SHAPIRO M.Pathologic changes in blood of the greater wax moth,Galleriamellonella,during the course of nucleopolyhedrosis and starvation II .Differential hemocyte count[J].JournalofInvertebratePathology,1968,10(2):230 -234.

[22]吕鸿声.昆虫病毒与昆虫病毒病[M].北京:科学出版社,1982:251-261.

LÜ H SH.Insect Virus and Insects Virus Disease[M].Beijing:Science Press,1982:251-261(in Chinese).

[23]蒋素蓉,付凤玲.几种半人工饲料饲养粘虫的效果[J].四川农业大学学报,2006,24(2):232-234.

JIANG S R,FU F L.Effect of several meridic diets on armyworm rearing[J].JournalofSichuanAgriculturalUniversity,2006,24(2):232-234(in Chinese with English abstract).

[24]王艳蓉,黄敏,刘喜旺,等.梨小食心虫人工饲料的研究[J].西北农林科技大学(自然科学版),2011,39(5):61-166.

WANG Y R,HUANG M,LIU X W,etal.Artificial diet for larvae of the oriental fruit mothGrapholitamolesta(Busck)(Lepidoptera:Tortricidae)[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2011,39(5):161-166(in Chinese with English abstract).

[25]HOWELL J F.Rearing the codling moth on an artificial diet[J].JournalofEconomicEntomology,1970,63:1148-1150.

Effects of Artificial Diet on the Yield ofCydiapomonellaGranulovirus

LIU Guofeng,FAN Jiangbin,WU Zhengwei,LIANG Zhaojun and WANG Dun

(Ministry Education Key Laboratory of Plant Protection Resources & Pest Management,Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

Studies were designed to find the optimal diet for the proliferation ofCydiapomonellagranulovirus Zhangye strain (CypoGV-ZY), which can lay the foundation for virus production. Four main nutrients, including apple powder, yeast, wheat flour and corn flour, were used to determine the effect of different artificial diet on the development ofC.pomonellaand the yield of CypoGV by stomach toxicity. The result showed that the CypoGV-ZY infected larvae mass and yield of virus were significantly improved with the yeast adding in diet. The formula C diets fed virus infected larvae would gain the highest CypoGV-ZY yield, and the dead larvae mass, the virus yield of average per larva and the virus yield of average per gram dead larva were 30.57 mg, 8.63×109and 28.25×1010g-1, respectively. Compared to C formula diets, the replacement of wheat flour by corn flour would lead to lower CypoGV production and dead larvae mass. In conclusion, the artificial diet formula C containing yeast and wheat flour, which significantly improved the yield of CypoGV-ZY, could be a suitable diet for virus propagation.

Cydiapomonellagranulovirus; Artificial diet; CypoGV-ZY yield

2015-04-05

2015-05-13

National Natural Science Foundation of China (No.31170609,31270691);Provincial Grant of Scientific Innovation(2014KTCL02-14).

LIU Guofeng,male,master.Research area:integrated pest management.E-mail:mail369feng@163.com

WANG Dun,male,professor,Ph.D,doctoral supervisor.Research area:insect molecular biology and resource entomology.E-mail: dunwang@foxmail.com

(责任编辑：成敏Responsible editor:CHENG Min)

2015-04-05修回日期：2015-05-13

国家自然科学基金(31170609，31270691)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(2014KTCL02-14)。

刘国锋，男，硕士研究生，研究方向为有害生物综合治理。E-mail：mail369feng@163.com

王敦，男，教授，博士，博士生导师，主要从事昆虫分子生物学及昆虫资源利用研究。E-mail：dunwang@foxmail.com

Q786；S436.611. 2+9文献标志码A文章编号1004-1389(2016)07-1092-05