‘中华猕猴桃’根皮提取物抗烟草花叶病毒活性测定

2016-07-14魏志平张秀云

西北农业学报 2016年7期

关键词：花叶病毒抑制率猕猴桃

魏志平，沈　静，周　玉，张秀云

(西北农林科技大学无公害农药研究服务中心，陕西杨凌　712100)

‘中华猕猴桃’根皮提取物抗烟草花叶病毒活性测定

魏志平，沈静，周玉，张秀云

(西北农林科技大学无公害农药研究服务中心，陕西杨凌712100)

为开发出对环境友好的植物源抗病毒剂，以烟草花叶病毒(TMV)为供试病毒，采用半叶枯斑法测定‘中华猕猴桃’根皮乙醇提取物和不同极性萃取物的抗病毒活性。结果显示， 10 g/L‘中华猕猴桃’根皮乙醇提取物(乙醇体积分数为95%)对TMV体外钝化、抑制初浸染及抑制增殖的活性分别为83.55%、49.51%和48.44%；不同极性溶剂萃取物的活性也存在差异，其中，水相的活性较强，对TMV的体外钝化、抑制初浸染及抑制增殖的活性分别为97.49%、54.11%和64.01%，其次是正丁醇萃取物，分别为 56.64%、27.32%和57.76%。

中华猕猴桃(ActinidiachinensisPlanch)；烟草花叶病毒；体外钝化活性；抑制初浸染活性；抑制增殖活性

烟草花叶病毒病是一种重要的病害。在烟草生产中，烟草花叶病毒广泛分布于中国各烟草种植区[1]。烟草花叶病毒病不仅影响烟叶产量和外观品质，也使上等烟草比例下降，造成巨大的经济损失。因此，烟草花叶病毒病已经成为当前制约中国高品质烟叶生产的重要因素[2]。

‘中华猕猴桃’是猕猴桃属的一种，是中国特有的品种，主要分布于中国陕西、江西、湖南、湖北、福建、浙江、安徽等省[3]。猕猴桃全株有药用作用，中医认为，其根皮冷，味道苦涩，活血消肿，驱逐风和湿、利尿、止血、功效热，可治疗肝炎、类风湿性关节炎、痢疾、丝虫病、胃癌、乳腺癌等疾病[4]。现代药理研究发现，猕猴桃的根皮可有效清除活性氧自由基，有防病毒、护肝脏、抑制肿瘤细胞生长、增强免疫力等功效。近年来，作为传统中药，对猕猴桃根皮在医药方面作用有很多研究，但在农业应用方面研究较少。陈靠山等[5]研究发现，猕猴桃根皮提取物对小菜蛾、菜青虫、蚜虫均有较强的忌避、触杀和胃毒作用。

与有机合成农药相比，植物源农药有选择性高、毒性低、易降解、不容易产生耐药性等特点[6]，尤其在抗植物病毒方面效果明显。目前，紫茎泽兰、商陆、臭椿等植物粗提物均已被证实具有较强的抗植物病毒活性[7-8]。近年来，西北农林科技大学无公害农药研究服务中心在筛选具有抗植物病毒活性的资源时发现，‘中华猕猴桃’根皮具有较强的抗植物病毒活性。因此，本研究对‘中华猕猴桃’根皮的粗提取物进行初步分离，分别测定不同极性萃取段的活性，以期进一步确定猕猴桃根皮的抗病毒活性成分，明确活性化合物的结构和性质，为开发新型植物源农药奠定基础。

1材料与方法

1.1供试病毒与植物

‘中华猕猴桃’根皮采自秦岭，经鉴定后在阴凉处自然风干，小型植物粉碎机粉碎，过50目筛。供试病毒为烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)普通株系，由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心保存；供试TMV局部枯斑寄主为心叶烟，TMV系统侵染寄主为普通烟(Nicotianatabacum)‘K326’品系，均在防虫网温室培育。

1.2‘中华猕猴桃’根皮提取物的制备

称取猕猴桃根皮干粉，用φ=95%的乙醇浸泡提取3次，合并3次提取液，旋转蒸发仪减压浓缩至膏状，得到乙醇提取物，留少量浸膏备用；将乙醇提取物用水捏溶，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次各萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发仪减压浓缩至膏状，分别得到各萃取段浸膏及水相浸膏。分别称取不同萃取物的浸膏适量，配制成10 g/L的提取物溶液，备用。

1.3抗病毒生物活性测定

1.3.1对TMV体外钝化作用采用半叶枯斑法[9]。选取健康、叶片大小一致、4～6叶期的枯斑寄主，TMV的枯斑寄主为心叶烟。将10 g/L提取物溶液与20 mg/L病毒汁液等体积混合后，钝化10 min，立即用食指沿叶脉方向轻轻摩擦接种于心叶烟左半叶，以右半叶接种病毒液与PBS水的等体积混合液作为对照。每株接种5片叶，每次处理3株。3 d后统计枯斑数量，计算抑制率。

抑制率=(对照平均枯斑数-处理平均枯斑数)/对照平均枯斑数×100%。

1.3.2抑制初侵染(预防)活性测定采用半叶枯斑法。选取健康、叶片大小一致、4～6叶期的烟苗作为寄主，沿叶脉方向将供试药剂涂抹于枯斑寄主的左半叶，右半叶涂抹PBS水溶液。24 h后分别用病毒汁液摩擦接种于整个叶片，病毒接种质量浓度为20 mg/L。每株接种5片叶，每次处理3株，3 d后统计枯斑数，按照 “1.3.1” 中抑制率计算公式计算抑制率。

1.3.3抑制增殖(治疗)活性测定采用半叶枯斑法。选取健康、叶片大小一致、4～6叶期的烟苗作为寄主，然后用食指沿叶脉方向轻轻摩擦病毒汁液接种于整个叶片，病毒接种质量浓度为20 mg/L。24 h后将供试药剂涂抹在枯斑寄主左半叶，右半叶用蒸馏水处理，每株接种5片叶，每次处理3株，3 d后统计枯斑数，按 “1.3.1” 抑制率计算公式计算抑制率。

2结果与分析

2.1体外钝化活性分析

‘中华猕猴桃’根皮乙醇提取物及各萃取物对TMV体外钝化活性见表1。由表1可知，乙醇提取物及不同溶剂萃取物对TMV均有一定的钝化活性，其中，水相对枯斑抑制率最高，达97.49%，其次为乙醇提取物，为83.55%，而石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取物的枯斑抑制率均低于60%。说明，‘中华猕猴桃’根皮中对TMV体外钝化活性的分子多为水溶性成分。

表1　‘中华猕猴桃’根皮提取物不同萃取段对TMV的体外钝化活性

注：数据均为3次重复平均值，同列数据后不同字母表示经Duncan’s新复极差法检验差异显著(P<0.05)。提取液质量浓度为10 g/L，下表同。

Note:Data are the means of 3 replicates, data with different letters in the same column are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. The mass concentrations of extract for test were 10 g/L,the same as below.

2.2抑制初侵染(预防)活性分析

‘中华猕猴桃’根皮乙醇提取物及各段萃取物对TMV的预防活性见表2。提前24 h用‘中华猕猴桃’根皮提取物及不同溶剂萃取物处理心叶烟，结果显示，乙醇提取物和正丁醇萃取物、水相均对心叶烟有较好的预防活性。其中，乙醇提取物对枯斑抑制率为49.51%，水相的活性稍有提高，为 54.11%，其他3种溶剂萃取物对枯斑抑制率均较低。由此可以看出，‘中华猕猴桃’根皮中抑制TMV初侵染活性的分子存在于极性较大的水相。

表2　‘中华猕猴桃’根皮提取物不同萃取段对TMV的抑制初侵染活性(预防)

2.3抑制增殖(治疗)活性分析

‘中华猕猴桃’根皮乙醇提取物及各段萃取物对TMV的治疗活性见表3。由表3可知，提前24 h对心叶烟接种病毒后，用‘中华猕猴桃’根皮乙醇提取物及不同溶剂萃取物进行处理，水相和正丁醇萃取物相的抑制率分别达到64.01%和57.76%，乙醇提取物对TMV抑制增殖率达48.44%。石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物抑制率很低，说明‘中华猕猴桃’根皮对TMV的抑制增殖活性部位在正丁醇和水相部分。

表3　‘中华猕猴桃’根皮不同萃取段对TMV抑制增殖(治疗)

注：“-”表示没有作用。

Note:“-”means no effect.

3讨论

从天然产物尤其从植物中获得农用活性成分是当前抗病毒剂的研究热点。植物中活性成分具有与环境友好、对人和动物低毒等优点。猕猴桃根皮作为传统中药，具有活血消肿、清热利尿、祛风利湿、散热止血的功效。现代药理学研究表明，‘中华猕猴桃’具有抗肿瘤、抗突变、抗病毒、降血脂、保肝、提高免疫力等多种药理活性[10-11]，具有广泛的开发前景，但猕猴桃根皮在农业上应用较少。有文献报道，猕猴桃具有一定的抑菌活性，并从‘中华猕猴桃’分离得到三萜类、黄酮类、甾醇类、糖类、有机酸等一系列活性化合物[12-14]。筛选具有农用活性的植物提取物时发现，‘中华猕猴桃’根皮乙醇提取物具有较强的抗烟草花叶病毒活性。进一步活性测试发现，‘中华猕猴桃’根皮乙醇提取物经不同极性溶剂萃取后，其抗病毒活性表现不同，总体来说，水相和正丁醇萃取物的活性较强，而石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物的活性较弱，甚至不表现抗病毒活性。水相在钝化、预防、治疗方面都显示出较好的活性，由此推测，‘中华猕猴桃’根皮提取物中的抗病毒活性成分可能是极性较强的糖苷类，也可能是多糖或者糖蛋白等高分子化合物[15-18]，这为下一步进行活性成分分离提供了思路和依据。

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Anti-TMV Activity of the Extract ofActinidiachinensisPlanch. Root Bark

WEI Zhiping, SHEN Jing, ZHOU Yu and ZHANG Xiuyun

(Research and Development Center of Biorational Pesticide, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

In order to develop environmentally friendly source of plant anti-virus pesticide,the antiviral activities of the extract ofActinidiachinensisPlanch. root bark against tobacco mosaic virus (TMV) were tested by half leaf method.The results showed thatφ=95% Ethanol extract ofActinidiachinensisPlanch. root bark showed anti-TMV activities to some extent, with the inactivating, inhibiting infectivity and inhibiting multiplication activities of 83.55%,49.51% and 48.44% under the concentration of 10 g/L. Extracts with different polar solvents possessed diverse activities. The strongest activities appeared in water extract, with the inactivating, inhibiting infectivity and inhibiting multiplication activities of 97.49%, 54.11% and 64.01%, followed by n-Butanol phase, with the activities of 56.64%,27.32% and 57.76%. It is suggested that the anti-TMV compounds should be hydrosoluble.

ActinidiachinensisPlanch.; Tobacco mosaic virus (TMV); Inactivating activities; Inhibiting infectivity activities; Inhibiting multiplication activities

2015-12-07

2016-01-19

The Special Fund for Basic Scientific Research of Central University (Northwest A&F University).

WEI Zhiping, male, master student. Research area:pesticide chemistry. E-mail:18792763808@163.com

ZHANG Xiuyun, female, Ph.D,lecturer, master supervisor. Research area:pesticide chemistry. E-mail:zhangxiuyun@nwsuaf.edu.cn

(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

2015-12-07修回日期：2016-01-19

中央高校基本科研业务专项基金。

魏志平，男，硕士研究生，研究方向为农药化学。E-mail:18792763808@163.com

张秀云，女，博士，讲师，硕士生导师，研究方向为农药化学。E-mail:zhangxiuyun@nwsuaf.edu.cn

S482.1

1004-1389(2016)07-1087-05