杨聚奇 赵兴绪/甘肃农业大学



特异性PCR方法快速诊断假性皮疽组织胞浆菌

杨聚奇 赵兴绪/甘肃农业大学

马流行性淋巴管炎（epizootic lymphangitis，EL）是由伪皮疽组织胞浆菌（Histoplasma farciminosum）引起多种动物以形成淋巴管和淋巴结周围炎、肿胀、化脓、溃疡和肉芽肿结节为特征的慢性传染病。2014年8月18日，靖远县高湾乡农户家出现马、骡、驴等马属动物发病情况，发病动物初期出现跛行，四肢、颈部等皮肤出现豌豆大或核桃大的硬性结肿，后破溃流出黄白色或淡红色脓液，逐渐形成溃疡，继后肉芽增生，溃疡高于皮肤表面如蘑菇状或周围突起中间凹陷，易于出血，不易愈合。部分马属动物鼻黏膜有大小不同的黄色圆形或椭圆扁平隆起或鼻腔流出少量脓性鼻漏，眼睑结膜部有溃疡性结膜炎。8月20日～23日接到部分户主电话，为了找出引起暴发的可能病因及风险因素，8月25日开始介入调查，10月27日结束，期间共到高湾乡7次收集信息，并采集典型病例的患病部位病料进行实验室诊断。

一、假性皮疽组织胞浆菌H212分离株内含肽Prp8前体基因PCR检测与鉴定

（一）相关试剂

DL2000 DNA Marker，Agarose Gel DNA Extraction Kit 均购自OMEGA公司，DNA提取试剂盒为Roche罗氏，TaKaRa PCR Amplification Kit 购于大连宝生物。

（二）引物设计与合成

根据参考基因序列（GenBank： JX274629.1），利用 Primer Premier 5.0 设计并合成了用于鉴定假性皮疽组织胞浆菌中（Histoplasma capsulatum var. farciminosum isolate H212 intein-containing Prp8 precursor）基因的特异性引物，引物序列由大连宝生物合成。

上游-F： 5'TCGCATTAG-TATTGACGCTGAC 3'

下游-R：5'AGAGCTG-GTCTTTATCGACTCTG 3'

（三）假性皮疽组织胞浆菌基因组的提取

1.取收集的病料置37℃/-20℃的条件下反复冻溶3次，吸取上清液200μl，加入200 ul trizol，剧烈振荡30 s，12 000 rpm离心2 min；

2.取上清200 ul，加入100 ul的苯酚和100 ul的氯仿，剧烈振荡30 s，12 000 rpm 离心2 min；……