于兆进，江茜，韩丽，关舒，颜媛媛，魏敏杰，何苗△



miR-100表达与乳腺癌患者淋巴结转移及FZD-8表达的相关性研究

于兆进1，江茜1，韩丽1，关舒2，颜媛媛1，魏敏杰1，何苗1△

摘要：目的考察临床乳腺癌病理组织中miR-100和Wnt通路关键因子卷曲蛋白（FZD）-8表达之间的关系，并分析miR-100表达与乳腺癌患者淋巴结转移的关系。方法选取中国医科大学附属第一医院乳腺外科术后的50例乳腺癌患者，通过原位杂交检测乳腺癌患者病理组织及其配对的癌旁组织中miR-100的表达；免疫组化检测2种组织中FZD-8的表达；比较有无淋巴结转移患者癌组织中miR-100表达情况，分析乳腺癌组织miR-100与FZD-8表达的相关性。结果miR-100在乳腺癌组织中的表达明显低于其配对的癌旁组织［2.00（1.00，3.00）vs.6.00（3.50，8.00）］；有淋巴结转移者癌组织中miR-100低表达［1.50（1.00，2.75）vs.3.00（2.00，4.00）］；与癌旁组织相比，FZD-8在乳腺癌组织中高表达［8.00（6.00，9.00）vs.6.00（3.75，9.00）］，且其表达水平与miR-100的表达呈负相关（rs=-0.592，P＜0.001）。结论miR-100作为抑癌miRNA参与乳腺癌转移的调节，可能与其调控FZD-8的表达有关。

关键词：乳腺肿瘤；淋巴转移；Wnt蛋白质类；微RNAs；miR-100；Wnt通路；卷曲蛋白8

△通讯作者E-mail：hemiao_cmu@126.com

Wnt信号通路是一条高度保守的通路，参与细胞增殖、分化、生存、凋亡等细胞生物过程的调节［1］。卷曲蛋白（Frizzled，FZD）-8是Frizzled受体家族主要成员之一，在Wnt信号通路介导的肿瘤发生发展中发挥重要作用［2］。已有研究证实miR-100靶向抑制同源基因（HOX）A1，可进而抑制肿瘤的增殖、侵袭及转移［3］。但是，关于miR-100与乳腺癌侵袭转移的关系有待深入研究。本研究检测了临床乳腺癌患者病理组织中miR-100和FZD-8的表达，分析两者的相关性，以及miR-100表达与乳腺癌患者淋巴结转移的关系，旨在探讨miR-100介导乳腺癌转移的机制。

1　材料与方法

1.1实验材料50例乳腺癌组织及其配对的癌旁组织，来自中国医科大学附属第一医院乳腺外科病房2011年1月—2012年12月间实施手术的女性乳腺癌患者，年龄34～72岁，平均（47.6±11.8）岁；收集经病理诊断明确的淋巴结转移情况，其中乳腺癌发生淋巴结转移者32例，未发生淋巴结转移者18例；患者术前均未接受放疗或化疗。抗体FZD-8购自美国Abcam公司；SP超敏浓缩试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；地高辛标记的miR-100寡核苷酸探针由上海生工生物工程股份有限公司合成；原位杂交检测试剂盒（Enhanced Sensitive ISH Detection KitⅡ）购自武汉博士德公司。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色乳腺癌组织微阵列芯片经二甲苯脱蜡，降梯度乙醇脱苯、水化。将芯片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），高压修复8～10 min。3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶；正常山羊血清封闭；PBS稀释的一抗FZD-8（1∶200）4℃孵育过夜。次日芯片经生物素标记的二抗（1∶200）37℃孵育30 min；链霉素抗生物素-辣根过氧化物酶（1∶200）37℃孵育30 min；滴加新鲜配制的DAB溶液显色。苏木素复染。脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后观察。同步操作阴性对照，即癌旁组织，采用PBS液代替一抗。

1.2.2原位杂交组织切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯、水化；3%过氧化氢处理10 min；蛋白酶K（20 mg/L）37℃孵育15 min；预杂交液中37℃预杂交2 h；杂交液中37℃杂交过夜。10%正常山羊血清37℃孵育30 min；生物素标记的鼠抗地高辛37℃孵育60 min；SABC-AP 37℃孵育30 min。苏木素复染等步骤同上。

1.2.3结果判定miR-100及FZD-8表达均按着色细胞百分率与染色强度两者记分乘积计分。着色细胞百分率：＜5%染色记为0，5%～25%染色记为1，26%～50%染色记为2，51%～75%染色记为3，＞75%染色记为4。染色强度：无染色记为0，弱阳性记为1，中等强度记为2，强阳性记为3。

1.3统计学方法采用SPSS 16.0统计软件包分析数据，因miR-100及FZD-8表达评分为非正态分布的连续变量，采用中位数和四分位数［M（P25，P75）］表示，两组间miR-100及FZD-8表达水平比较采用Mann-Whitney U test分析；采用Spearman相关系数来描述miR-100及FZD-8表达的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miR-100在乳腺癌组织中的表达原位杂交结果显示，miR-100在癌组织中染色程度与癌旁组织相比明显减弱，见图1。癌组织中miR-100表达水平显著低于癌旁组织［2.00（1.00，3.00）vs.6.00 （3.50，8.00），Z=5.235，P＜0.001］。

Fig.1　Figures showingmiR-100 expression in breast cancer tissues and adjacent normal tissues measured by in situ hybridization（ISH，×200）图1　乳腺癌患者癌组织及癌旁组织中miR-100的表达（原位杂交，×200）

2.2乳腺癌组织中miR-100表达与淋巴结转移的关系有淋巴结转移肿瘤组织中miR-100表达水平显著低于无淋巴结转移肿瘤组织［1.50（1.00，2.75）vs.3.00（2.00，4.00），Z=3.041，P=0.002］。

2.3乳腺癌组织中FZD-8与miR-100的相关性免疫组化结果显示，FZD-8在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织［8.00（6.00，9.00）vs.6.00（3.75，9.00），Z=3.201，P=0.001］，见图2。相关分析显示FZD-8与miR-100表达呈负相关（rs=-0.592，P＜0.001）。

Fig.2　Figures showingthe expression of FZD-8 in human breast cancer tissues and adjacent normal tissues analyzed by immunohistochemistry（IHC，×200）图2　乳腺癌患者癌组织及癌旁组织中FZD-8的表达（免疫组化，×200）

3　讨论

3.1miR-100与乳腺癌转移的关系侵袭转移是乳腺癌患者预后不良、引起死亡的最主要原因，因此寻找抑制乳腺癌转移的新靶点势在必行。miRNA是一类长度约为21～23个核苷酸的小分子非编码RNA，在多种生物学过程中起着重要的调控作用。一些miRNAs已被发现作为抑癌基因在抑制肿瘤的转移中发挥重要作用。Nishikawa等［4］报道miR-29可直接靶向laminin信号在前列腺癌中抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。有研究报道miR-100在口腔癌、肾上腺皮质癌、肝细胞癌、卵巢癌和膀胱癌中低表达［5-7］。Gebeshuber等［8］报道miR-100能靶向抑制胰岛素样生长因子2的表达，从而抑制乳腺癌的进展。最近，Chen等［9］也报道了miR-100通过转录后调节polo样激酶1（PLK1）表达，进而抑制卵巢癌上皮细胞的生长。Petrelli等［10］也证实了miR-100通过抑制PLK1抑制了乳腺癌干细胞干性的维持。本研究通过原位杂交检测发现miR-100在乳腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织，且在有淋巴结转移患者中低表达，提示其可能作为抑癌miRNAs抑制乳腺癌的转移。

3.2miR-100与FZD-8表达的关系肿瘤细胞所处微环境中复杂的信号通路，如Wnt、转化生长因子（TGF）-β、Notch等信号通路的相互作用介导了肿瘤侵袭转移的过程［11］。当Wnt在细胞膜表面与FZD和低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）5/6结合后，激活经典或非经典的Wnt通路，抑制β-连环蛋白（β-catenin）-轴蛋白（AXIN）-腺瘤状结肠息肉蛋白（APC）-糖原合成酶激酶（GSK）3β复合物的形成，增加β-catenin的稳定性与入核，促进下游靶基因的转录，促进肿瘤的发生发展［12］，可见Wnt信号通路的激活在肿瘤的发展转移中发挥重要作用。一些miRNAs被证实能够靶向调节Wnt通路的关键因子，从而参与肿瘤细胞生物学功能的调控。研究发现miR-612可通过抑制Wnt信号通路来抑制肝癌细胞的干性、侵袭和迁移［13］。Subramanian等［14］研究显示miR-29通过下调β-catenin的共激活子的表达，抑制肠癌细胞Wnt信号通路的功能。FZD-8为Wnt信号通路受体卷曲蛋白家族中的一员，在Wnt通路活性调控中发挥重要作用。已有研究发现FZD-8在三阴性乳腺癌细胞中高表达，抑制FZD-8的表达能够抑制Wnt通路的活性，并明显增加三阴性乳腺癌细胞的药物敏感性［15］。而本研究是在乳腺癌病理组织中进行FZD-8表达水平检测，且未考虑乳腺癌三阴性分子表型，亦发现FZD-8在乳腺癌中高表达，这提示乳腺癌中FZD-8并非三阴性表型者独有的标志分子，这可在更大样本的组织标本中进行FZD-8检测予以进一步确认。本研究通过免疫组化检测发现FZD-8在临床乳腺癌患者病理组织中的表达明显高于癌旁组织，且其表达与miR-100的表达呈负相关，提示miR-100和FZD-8有望成为评价乳腺癌患者预后的重要指标，靶向FZD-8可能为临床乳腺癌的治疗提供重要线索。

参考文献

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（2015-11-25收稿2016-03-02修回）

（本文编辑李鹏）

The correlation of miR-100 expression with lymph node metastasis and FZD-8 protein expression in patients with breast cancer

YU Zhaojin1，JIANG Qian1，HAN Li1，GUAN Shu2，YAN Yuanyuan1，WEI Minjie1，HE Miao1
1 Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China；2 Department of Breast Surgery，The First Affiliated Hospital of China Medical University Corresponding AuthorE-mail：hemiao_cmu@126.com

Abstract：ObjectiveTo evaluate the expression and relationship of miR-100 and FZD-8，one of the major components of Wnt signaling pathway，and the correlation of their expressions with lymph node metastasis in patients with breast cancer.MethodsThe expression of miR-100 was determined in 50 samples of human breast cancer tissues and adjacent normal tissues by in situ hybridization.The correlation of miR-100 expression with lymph node metastasis was analyzed by Mann-Whitney U test.The expression of FZD-8 was measured in 50 samples of human breast cancer tissues and adjacent normal tissues by immunohistochemistry.The correlation of the miR-100 expression with the protein expression of FZD-8 was evaluated by Pearson rank analysis.ResultsThe expression of miR-100 was significantly lower in human breast cancer tissues than that in adjacent normal breast tissues［2.00（1.00，3.00）vs.6.00（3.50，8.00）］.The miR-100 expression was lower in patients with lymph node metastasis than that in patients without lymph node metastasis［1.50（1.00，2.75）vs.3.00 （2.00，4.00）］.The expression of FZD-8 was significantly higher in human breast cancer tissues than that in adjacent normal breast tissues［8.00（6.00，9.00）vs.6.00（3.75，9.00）］.The miR-100 expression was negatively correlated with the FZD-8 protein expression in human breast cancer tissues（rs=-0.592，P＜0.001）.ConclusionThe miR-100，as an anti-metastasismiRNA，may involve in the metastasis of breast cancer，which may be related with the regulation of the expression of FZD-8.

Key words：breast neoplasms；lymphatic metastasis；Wnt proteins；microRNAs；miR-100；Wnt pathway；FZD-8

中图分类号：R737.9

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150333

基金项目：辽宁省高校创新团队支持计划资助项目（LT2014016）；沈阳市科技计划项目（F14-232-6-05）

作者单位：1中国医科大学药学院药理教研室（邮编110122）；2中国医科大学附属第一临床医院乳腺外科

作者简介：于兆进（1983），男，讲师，硕士，主要从事分子肿瘤药理学研究