郝俊芳，黄　凯，王月影，杜丽丽，钟　凯*

(1.河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室，郑州 450002；2.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002)



炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎性反应中的表达及miR-223真核表达载体的构建

郝俊芳1，2，黄凯2，王月影1，2，杜丽丽1，2，钟凯1，2*

(1.河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室，郑州 450002；2.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002)

摘要：小分子RNA (miRNA)是近年来发现的一类内源性、非编码单链小RNA，其在乳腺组织免疫防御过程中发挥的调控作用逐渐引起了人们的关注。作者拟用qRT-PCR检测炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应中的表达变化；构建3种miR-223真核表达载体并检验重组载体的转染效率。用不同浓度 LPS处理小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)48 h，qRT-PCR检测miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155的表达变化。以EpH4-Ev细胞基因组DNA为模板，PCR扩增pre-miR-223序列，以质粒Minicircle、pcDNA3.1(+)和转座子piggyBac为母本构建3种miR-223真核表达载体，将其转染EpH4-Ev细胞，通过观察荧光、qRT-PCR检测miR-223的表达，评价重组质粒转染效率。结果：qRT-PCR检测结果表明，LPS诱导EpH4-Ev细胞炎症反应时，4种炎症相关miRNAs的表达均显著 (P<0.05或P<0.01) 增加，并呈现不同程度的剂量依赖性；重组质粒转染 EpH4-Ev细胞后，qRT-PCR检测结果显示，Mini-miR-223质粒转染组的miR-223表达水平无统计学差异(P>0.05)；PB-miR-223和pcDNA-miR-223转染EpH4-Ev细胞后，miR-223的表达均极显著(P<0.001)增加。本研究表明炎症相关miRNAs参与LPS诱导小鼠EpH4-Ev细胞的炎性反应过程。成功构建3种miR-223真核表达载体，为后续miRNAs在乳腺炎症反应中的功能研究奠定基础。

关键词：炎症相关miRNAs；乳腺上皮细胞；LPS；真核表达载体；乳腺炎

小分子RNA (microRNA，miRNA)是近年来发现的一类内源性的非编码单链小RNA，其大小为20～25个碱基，通过直接结合到靶mRNA分子的3′非翻译区(3′ untranslated regions，UTRs)，在转录后水平对靶mRNAs进行降解或翻译抑制来参与基因表达的调控[1-2]。研究表明miRNA参与众多生理疾病过程的调控，包括炎症反应[3]。奶牛乳房炎(bovine mastitis)是迄今为止世界范围内仍未得到有效解决的顽疾，严重影响养殖业和乳业的发展[4]。miRNAs在奶牛乳房炎症反应过程中的调控作用已逐渐引起了研究者的关注。

2014年，多位研究者[5-7]利用下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)对病原菌入侵乳腺组织时，动物机体miRNA表达谱的变化进行了研究。研究结果表明，在病原菌引起乳腺组织炎症反应时，miRNAs的表达均发生了显著变化。F.Dilda等[8]对LPS和S.aureus内毒素B诱导的牛单核细胞中5种炎症相关miRNA(inflammation related miRNAs)——miR-9、miR-125b、miR-155、miR-146a、miR-223的表达变化进行了研究。A.Naeem等[9]利用qRT-PCR对乳房链球菌感染的奶牛乳腺组织中几种miRNAs(miR-16、miR-146a/b、miR-155、miR-181a、miR-223)的表达进行了研究，并用生物信息学方法预测和分析了miRNA的靶基因。上述研究结果均表明，一些miRNAs在乳腺炎症反应过程中发挥了重要的调控作用[10]，但更加深入的研究还未见报道。

由革兰阴性菌——大肠杆菌引起的奶牛乳房炎较为常见[11]，而脂多糖(LPS)是革兰阴性菌的主要致病因子[12]，其诱发的炎症反应和革兰阴性菌感染引起的炎症变化相似。乳腺上皮细胞是研究乳腺功能的重要体外模型，是病原菌穿越乳导管进入乳腺后首先接触的细胞，因此充当了防御乳腺感染的第一道防线。研究发现乳腺上皮细胞除了合成乳中的主要营养成分外，能产生多种免疫活性因子，例如细胞因子、趋化因子和宿主防御肽等[13-15]，因此其在乳腺感染的过程中发挥着免疫防御的功能。

本研究以不同浓度的LPS诱导小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)发生炎症反应，qRT-PCR检测几种炎症相关miRNAs的表达变化，验证炎症相关miRNAs是否参与乳腺上皮细胞免疫防御反应的调控；构建包含miR-223前体序列的3个类型真核表达载体，对比其过表达的效率，筛选出理想的miRNA真核过表达载体，为进一步深入研究miRNAs在乳腺炎症发生和发展中的作用提供有力工具。

1材料与方法

1.1试验材料

小鼠乳腺上皮细胞系EpH4-Ev (ATCC，美国)； LPS(Sigma-Aldrich，美国)；SYBR®PrimeScript miRNA RT-PCR Kit (宝生物，大连)；限制性内切酶XbaⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶和DL2000、15000 marker(NEB，美国)；胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒及PCR纯化试剂盒(上海生工)；Plasmid Midi Kit (25) (QIAGENE，德国)； Minicircle DNA 和piggyBac Transposon 质粒载体(SBI，美国)；pcDNA3.1(+)质粒和LipofectamineTM2000(Invitrogen，美国)；嘌呤霉素(puromycin，Sigma，美国)；细胞荧光成像分析仪(Smart fluorescent Cell analyzer Digital Bio，韩国)；E.coliTop10和ZYCY10P3S2T感受态细胞为本实验室保存。

1.2细胞培养

EpH4-Ev细胞培养于含10%的胎牛血清、4.0 mmol·L-1L-谷氨酰胺、4 500 mg·L-1葡糖糖、不含丙酮酸钠的HyClone完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，贴壁后，体积明显增大，待细胞密度达95%时，呈铺路石样生长。

1.3细胞处理及分组

按1×106·孔-1将EpH4-Ev细胞，接种于六孔板，过夜培养，待细胞融合度达80%～90%时，以1、5、10 μg·mL-13个水平的LPS处理EpH4-Ev细胞，未经处理的EpH4-Ev细胞作为对照组，每组设3个复孔，48 h后收集细胞。

1.4总RNA提取及qRT-PCR检测炎症相关miRNAs的表达变化

利用1 mL的RNAiso Plus裂解细胞，提取总RNA。miRNAs反转录采用poly(A)加尾法，按照TaKaRa公司试剂盒说明书将其反转录为cDNA。qRT-PCR反应体系：5 μL 2xSYBR Premix Ex TaqⅡ；上下游引物各 0.1 μL(20 μmol·L-1)；1.25 μL cDNA，DEPC水补齐10 μL，反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环，U6作为内参检测miRNA的表达水平，所有操作均在冰上完成。qRT-PCR的下游引物是miRNA通用引物，上游引物，见表1。

表1miRNAs定量PCR引物序列

Table 1Primer sequence of miRNAs used for qRT-PCR

1.5pre-miR-223引物设计与合成

根据miRBase数据库中预测的小鼠miR-223前体序列，插入序列不仅包含pre-miR-223，而且，同时向其上下游两端的侧翼幅跨100～200 bp序列，以保证高水平的表达pre-miR-223，扩增产物长度约为432 bp。引物序列如下：上游5′-tctagaGCCACCCACCCAGGATCCCCGTTTTT-3′(划线部分依次为XbaⅠ酶切位点、Kozak序列)，下游5′-gaattcTGTAGACCCCAGAGCTGCAT-3′(划线部分为EcoRⅠ酶切位点)。

1.6miR-223真核表达载体的构建与鉴定

以小鼠EpH4-Ev细胞基因组DNA为模板，扩增目的基因，将带有酶切位点的miR-223片段和3个质粒分别用XbaⅠ、EcoRⅠ双酶切，并用 T4 DNA连接酶连接。重组质粒转化E.coliTop10，Minicircle质粒用卡那霉素筛选，piggyBac和pcDNA3.1(+)质粒用氨苄霉素筛选。挑单克隆菌落，做菌液PCR，电泳鉴定的阳性菌送上海生工测序。测序结果和pre-miR-223的序列用BiXM2.6软件进行序列比对分析。构建成功的miR-223表达质粒命名为Mini-miR-223、PB-miR-223和pcDNA-miR-223。

1.7重组质粒转染EpH4-Ev细胞

106·孔-1的EpH4-EV细胞接种于六孔板，细胞融合度需达80%，在转染前2 h更换成无血清物无双抗的DMEM。空载质粒为阴性对照组，重组质粒为试验组，每组设3个复孔。转染试剂用LipofectamineTM2000，具体操作步骤如下：用100 μL·孔-1预冷的无血清无双抗的培养液分别进行稀释2 μg DNA和5 μL的LipofectamineTM2000，室温静置5 min后，将两者混合，室温静置20 min，缓慢均匀滴入孔内，6 h更换培养液。PB-miR-223质粒需按1∶0.8的比例添加PBase酶。转染24 h后将各组细胞在Smart fluorescent Cell analyzer仪上观察miRNAs重组质粒的GFP表达[pcDNA3.1(+)表达载体不含绿色荧光蛋白基因]，并采集图像。同时，用12孔板测定嘌呤霉素对EpH4-Ev细胞的筛选浓度为8 μg·mL-1，转染PB-miR-223质粒的EpH4-Ev细胞经筛选12 d，传代3～4次，形成稳定过表达miR-223基因细胞系。反转录如前所述，qRT-PCR检测成熟miR-223表达。

1.8数据处理

2结果

2.1LPS诱导EpH4-Ev细胞炎症反应时炎性相关miRNAs的表达变化

与对照组相比，LPS刺激后EpH4-Ev细胞的4种炎症相关miRNAs的表达均呈现增加趋势(图1)。5 μg·mL-1LPS处理组的4种炎症miRNAs的表达显著升高(P<0.05或P<0.01)，而10 μg·mL-1LPS处理组的4种miRNAs的表达极显著升高(P<0.01)，结果表明，4种炎症相关miRNAs在LPS刺激后表达均显著增加，并呈现明显的剂量依赖性。

2.2pre-miR-223基因的PCR扩增

以EpH4-Ev细胞基因组DNA为模板，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物片段大小约为432 bp，与预期大小相符(图2)。

2.3单酶切鉴定诱导的Mini-miR-223微环

用EcoRⅠ单酶切诱导前的MP-miR-223质粒和诱导后Mini-miR-223质粒，电泳结果显示：在7 487 bp和 3 432 bp左右各有1条特异性条带(图3)，与预期值一致，证实微环DNA诱导成功。

2.4Mini-miR-223、PB-miR-223转染EpH4-Ev细胞后EGFP的表达

EpH4-Ev细胞中Mini-miR-223质粒瞬时表达和PB-miR-223质粒的稳定表达见图4。

2.5qRT-PCR检测3种真核表达载体转染EpH4-Ev细胞后miR-223的表达

如图5所示，与对照组相比，Mini-miR-223、质粒转染EpH4-Ev细胞后，miR-223的表达无显著变化(P>0.05)；转染PB-miR-223质粒的细胞，经8 μg·mL-1Puro筛选形成的稳定细胞系可以有效过表达miR-223，与对照组相比，miR-223的表达极显著增加(P<0.001)；pcDNA-miR-223质粒转染细胞后，miR-223的表达极显著增加(P<0.001)。以上结果表明PB-miR-223和pcDNA-miR-223重组质粒能够在EpH4-Ev细胞中高效特异性的过表达成熟的miR-223。

3讨论

奶牛乳房炎一直是困扰奶牛养殖业的常见病和多发病，人们对其发病机制已进行了多年的研究仍未有大的突破，因此，研究者需要寻找参与乳房炎病理过程中新的靶分子及其适当的调控途径。MicroRNAs作为一类新的基因表达调控分子参与机体稳态调节，其参与了众多疾病的病理过程，可作为疾病诊断标志物或干预治疗的靶标。miRNAs在奶牛乳房炎发生发展中作用的研究尚处于起步阶段，仍有许多未知领域需要更加深入的研究。前人的许多研究多关注于miRNAs在免疫细胞炎症反应中所发挥的作用，而本研究以乳腺上皮细胞为研究对象，利用qRT-PCR检测几种炎症相关miRNAs在LPS人工诱导的炎症反应中的表达变化。

前人的研究已证明miR-223在粒细胞的增殖与分化过程中发挥了重要作用。L.M.Li等[17]研究发现，与健康的对照组乳腺组织相比，S.aureus感染的乳腺组织中miR-223的表达上调了1.95倍(P<0.05)，该研究还证实高迁移率族蛋白1(high-mobility group box protein 1，HMGB1)是miR-223的靶基因之一，HMGB1的3′-UTR的单核苷酸多态性(SNP)与奶牛乳房炎的易感性有关。A.Naeem等[9]研究发现，用链球菌感染动物健康乳腺组织后，miR-223明显上调2.5倍。本研究结果表明，不同浓度LPS刺激EpH4-Ev细胞48 h 后，miR-223的表达呈剂量依赖性增高。这表明，大肠杆菌(LPS)导致的乳腺炎症反应与S.aureus、S.ubiris引发的乳房炎一样，miR-223的表达显著升高。这也与其他研究[18-19]的结果相似。miR-181a主要表达于B淋巴细胞，在乳腺癌[20]、胃癌[21]高表达，发挥着类似抑癌基因的功能，这个研究结果进一步证实miR-181a对早期乳腺炎症反应的调控作用。miR-146a[22-23]作为与炎症反应密切相关的重要分子，也是研究其功能最多的miRNA之一。K.D.Taganov等[22]用 LPS刺激THP-1细胞，发现miR-146a表达较对照组显著增高，其通过靶基因的翻译抑制，参与炎症反应。miR-155 参与多种炎症过程，人单核细胞受LPS刺激后，miR-155的表达增高[22]，同样，正常人纤维细胞的炎症介质可以诱导miR-155的表达升高[24]。该试验结果与上述miRNA在LPS等诱导的乳腺组织炎症反应中上调表达的趋势一致。

目前miR-223在奶牛乳房炎症作用及其机制仍缺乏报道，构建能够过表达miR-223的真核载体，是研究其对靶基因的调控作用和进行miRNA作用机制研究的基础。因此，本研究构建3个miR-223真核表达载体，对比其过表达miR-223的效率。Mini-miR-223微环的成功诱导是采用传统的L-阿拉伯糖介导的重组酶表达，得到一种含目的基因表达的微环 DNA[25-27]。Mini-miR-223质粒过表达效率低，原因之一，可能是由于其不含真核筛选基因，细胞在整合外源基因的过程中未加压传代[28]，使目的蛋白表达不断降低。当然不同细胞系本身的性质决定了转染效率。相比之下，piggyBac真核表达载体不仅含有哺乳动物的强启动子CMV，而且在EGFP间接反映重组质粒表达的同时，puro的真核筛选基因有助于筛选到稳定高效表达miR-223的EpH4-Ev细胞系。本试验PcDNA-miR-223质粒在EpH4-Ev细胞中的产物也具有生物活性。

本研究成功构建miRNA的真核表达载体，为进一步研究miRNA在奶牛乳房炎症发生发展过程中的调控机制奠定了基础。

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(编辑白永平)

Expression of Inflammation-related miRNAs in the LPS-induced Inflammation in Murine Mammary Epithelial Cells and Construction of miR-223 Eukaryotic Expression Vector

HAO Jun-fang1，2，HUANG Kai2，WANG Yue-ying1，2，DU Li-li1，2，ZHONG Kai1，2*

(1.KeyLabofRegulationonAnimalGrowthandDevelopmentofAgriculturalMinistryofChina，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

Key words:inflammation-related miRNAs；mammary epithelial cells；LPS；eukaryotic expression vector；mammary inflammation

Abstract:Small RNA (miRNA) is a class of endogenous，single strand，small non-coding RNAs，which is recently discovered.Its regulation in the process of immune defense in mammary tissue gradually attracted people’s attention.Expression changes of inflammation-related miRNAs have been detected in mouse mammary epithelial cells when inflammation reaction induced with LPS occurred with qRT-PCR；we have also constructed 3 kinds of miR-223 eukaryotic expression vectors and tested recombinant vectors transfection efficiency.Mouse mammary epithelial cells (EpH4-Ev cells) have been incubated with different dose of LPS for 48 h，then，expressions of miR-223，miR-146a，miR-181a and miR-155 have been detected with qRT-PCR.Genomic DNA of EpH4-Ev cells were used as a template and pre-miR-223 cDNA sequence was amplificated with PCR.PCR product was combined with Minicircle，pcDNA3.1(+) and piggyBac transposon，separately，to construct three kinds of miR-223 eukaryotic expression vectors.Three kinds of recombined vectors were transfected into EpH4-Ev cells，respectively.Expression of miR-223 was measured and green fluorescence was observed in order to evaluate transfection efficiency of recombinant plasmid.qRT-PCR results showed that expression of 4 kinds of inflammation-related in EpH4-Ev cells significantly increased when inflammation induced by LPS (P<0.05 orP<0.01)，and the expression change was in a dose-dependent manner.qRT-PCR results showed that the expression level of miR-223 had no significant change (P>0.05) when Mini-miR-223 plasmid transfected into the EpH4-Ev cells，while the expression of miR-223 significantly increased when PB-miR-223 and pcDNA-miR-223 transfected EpH4-Ev cells (P<0.001).Inflammation-related miRNAs have been showed involved in the process of inflammation induced by LPS in mouse EpH4-Ev cells.Three kinds of miR-223 eukaryotic expression vectors have been constructed successfully，and may contribute to further research of the modulation significance of miRNAs in the mammary gland immune reaction.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.025

收稿日期：2015-05-23

基金项目：国家自然科学基金(31470120)

作者简介：郝俊芳(1989-)，女，河南林州人，硕士生，主要从事泌乳生物化学研究，E-mail：haojunfang163@163.com *通信作者：钟凯(1974-)，女，河南郑州人，博士，副教授，主要从事泌乳生物化学研究，E-mail：zhongkai@henau.edu.cn

中图分类号：S857.26

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0183-07