赵　妮,邓　毅, 刘　靓,董金香,曼　琼,杨志军

(1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000)



甘草内生菌20株有效菌株发酵物与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷体外抑菌活性对比研究*

赵妮1,邓毅2, 刘靓1,董金香1,曼琼1,杨志军1

(1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000)

摘要目的：研究甘肃野生和栽培甘草内生菌有效菌株发酵物与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷体外抑菌活性的差异。方法：采用体外定量抑菌方法观察20株甘草内生菌有效菌株发酵物、水煎液、总黄酮、总皂苷对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌的抑菌活性。结果：各组对金黄色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)，各有效菌株组均弱于宿主组；有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相对较强，最小抑菌浓度分别为0.125 0 ，0.062 5 g/mL；宿主中野生、栽培甘草总黄酮抑菌活性相对较强。各组对肺炎链球菌均有抑菌活性(P<0.01)；与栽培甘草水煎液、总皂苷对比，JTZB005抑菌活性较强(P<0.01)，最小抑菌浓度0.062 5 g/mL；有效菌株中JTZB005抑菌活性相对较强，宿主中栽培甘草总黄酮抑菌活性相对较强。各组对大肠杆菌均有抑菌活性(P<0.01)；与栽培甘草水煎液、总黄酮对比，JTZB018抑菌活性较强(P<0.01)，最小抑菌浓度0.125 0 g/mL；有效菌株中JTZB018抑菌活性相对较强，宿主中野生、栽培甘草总黄酮抑菌活性相对较强。结论：20株甘草内生菌发酵物对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌均有不同程度抑菌活性，JTZB005对肺炎链球菌的抑菌活性强于栽培甘草水煎液、总皂苷，JTZB018对大肠杆菌的抑菌活性强于栽培甘草水煎液、总黄酮。

关键词甘草；内生菌；水煎液；总黄酮；总皂苷；抑菌活性；对比

甘草具有补中益气、清热解毒、止咳化痰、缓急止痛、调和诸药等功效。研究表明：甘草、甘草黄酮和甘草皂苷均有抑菌作用[1-2]。植物内生菌在与宿主共生过程中发生基因重组获得宿主植物基因，能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性，并具有多种生理活性。本实验将甘肃野生与栽培乌拉尔甘草分离纯化，经菌饼法筛选20株有效菌株，比较观察20株有效菌株与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷体外抑菌活性差异。

1材料与方法

1.1药品、试剂与仪器

野生、栽培乌拉尔甘草GlycyrrhizauralensisFisch.于2014年9月购于甘肃省酒泉市金塔县，经甘肃中医药大学生药实验中心林丽高级实验师鉴定为正品。将新鲜的野生与栽培甘草的根部泥沙清理掉，用保鲜膜分开包装，4 ℃保存。无水乙醇(批号20140718)、氨水(批号20141011)、乙酸乙酯(批号20141124)购自天津市百世化工有限公司；生理盐水，西安京西双鹤药业有限公司，批号1503217B。9082-B型电热恒温培养箱，上海福玛实验设备有限公司产品；LDZX-30FB立体压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品；SW-1F-CJ无菌操作台，上海新苗医疗器械制造有限公司产品；BS-110S 型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；CT14RD台式高速冷冻离心机，海天美生化仪器设备工程有限公司产品；KQ-500DE 型数控超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司产品；台式低速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司产品。

1.2菌种

金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)、肺炎链球菌(ATCC 6303)、大肠杆菌(CMCC 44102)，均购自兰州百源基因有限公司。

1.3培养基

营养琼脂(NA，批号20130106)、马铃薯葡萄糖培养基(PDA，批号20140812)、营养肉汤(批号20140923)、马铃薯葡萄糖水(批号20140821)，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.4甘草水煎液的制备

野生及栽培甘草破碎至1～3 mm长度，各取50 g 加5 00 mL水，浸泡30 min，武火加热，文火煎煮60 min，纱布滤过，滤液水浴浓缩至25 mL含生药量2 g/mL，冰箱保存备用。

1.5甘草总黄酮和总皂苷的制备

前期通过正交试验优选野生和栽培甘草总黄酮、总皂苷超声提取工艺结果。野生甘草总黄酮、总皂苷超声提取条件：提取温度50 ℃，提取时间45 min，乙醇体积分数600 mL /L，料液比1∶10。栽培甘草总黄酮和总皂苷提取条件：提取温度40 ℃，提取时间40 min，乙醇体积分数800 mL/L，料液比1∶10。将提取液浓缩，加氨水至溶液为碱性，用乙酸乙酯萃取4次，浓缩至固体，即得甘草总黄酮，质量分数为750 g/L。收集下层萃取液，加盐酸至pH值为1～2，冰箱静置，使甘草总皂苷充分沉淀，离心，取沉淀，干燥至恒重，即得甘草总皂苷，质量分数为450 g/L[3]。

1.6甘草内生菌有效菌株的筛选

参照参考文献[4]进行。 将野生和栽培甘草分别分离培养纯化[5]。野生甘草分离出63株内生菌，其中内生细菌31株，内生真菌32株；栽培甘草分离出77株内生菌，其中内生细菌63株，内生真菌14株。以菌饼法对分离的内生菌中的金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌分别进行体外抑菌筛选，对金黄色葡萄球菌抑制作用的有18株(JTYB006，029；JTYF023；JTZB002，005，006，014，016，018，020，043，054，058，059，060，062，063；JTZF011)，对肺炎链球菌抑制作用的3株(JTZB005，043；JTZF014)，对大肠杆菌抑制作用的3株(JTYB012；JTZB018，020)。

1.7甘草内生细菌发酵液的制备

参照参考文献[6]进行。将甘草内生细菌于营养琼脂中，25 ℃恒温培养2 d；将营养肉汤按每瓶100 mL分装至250 mL三角瓶中，121 ℃灭菌20 min；将活化的菌株用接种环各挑去3环菌种接种于相应液体培养基中，25 ℃、200 r/min摇床培养4 d；发酵完成后，4 ℃、12 000 r/min离心5 min；上清液采用0.22 μm过滤器过滤，60 ℃条件下烘干，备用。

1.8甘草内生真菌发酵液的制备

参照参考文献[6]进行。将甘草内生真菌于马铃薯葡萄糖培养基中，25 ℃暗箱培养7 d；将马铃薯水按每瓶100 mL分装于250 mL三角瓶中，121 ℃灭菌20 min；将活化后的菌株用打孔器打3个菌饼接种于马铃薯水中，25 ℃、200 r/min摇床培养7 d；发酵完成后，4 ℃、12 000 r/min离心5 min；上清液采用0.22 μm过滤器过滤，60 ℃条件下烘干，备用。

1.9检测指标

1.9.1对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌抑菌作用的测定

参照参考文献[7]进行。分别将金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌置恒温培养箱中37 ℃培养18 h，于试管壁上研磨并溶于2 mL生理盐水中，配置成相当于0.5麦氏比浊管浓度的菌液。用微量移液器吸取100 μL于直径为90 mm的无菌营养琼脂培养基上，三角玻璃棒涂布均匀，用直径为6 mm的无菌打孔器在涂菌的固体培养基上均匀且垂直打3个孔，呈正三角形。吸取相应药液于孔中，无菌蒸馏水做对照，各做3个平皿。37 ℃恒温培养18 h。用游标卡尺测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径，取其平均值进行统计分析，计算3个平皿9个孔的抑菌圈的平均值。

1.9.2各组最小抑菌浓度(MIC)的测定

参照参考文献[8]进行。在96孔板中每孔加入80 μL灭菌的营养肉汤培养基，按二倍稀释法加入1 g/mL的药液100 μL至第10孔，之后在第1～11孔中加入20 μL相当于0.5麦氏比浊管浓度的菌液，第12孔中加入20 μL无菌蒸馏水。37 ℃恒温培养48 h后观察培养液，澄清者表明有抑菌作用。

1.10统计学方法

2结果

2.1各有效菌株与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌的抑制作用

野生与栽培甘草内生菌有效菌株发酵物、水煎液、总黄酮、总皂苷对金黄色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)。各有效菌株组抑菌活性均弱于宿主组；有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相对较强，宿主中野生、栽培甘草总黄酮抑菌活性相对较强。见表1。

表1　对金黄色葡萄球菌抑菌圈值表　　±s

注：JTYB为野生甘草内生细菌，JTYF为野生甘草内生真菌，JTZB为栽培甘草内生细菌，JTZF为栽培甘草内生真菌。与无菌水对比，*P<0.05，**P<0.01；与野生甘草水煎液对比，##P<0.01；与栽培甘草水煎液对比，△P<0.05，△△P<0.01；与野生甘草总黄酮对比，＊＊P<0.01；与栽培甘草总黄酮对比，▲▲P<0.01；与野生甘草总皂苷对比，□□P<0.01；与栽培甘草总皂苷对比，■■P<0.01。

栽培甘草内生菌有效菌株、水煎液、总黄酮、总皂苷对肺炎链球菌均有抑菌活性(P<0.01)。与栽培甘草水煎液、栽培甘草总皂苷比较，JTZB005抑菌活性较强(P<0.01)。有效菌株中JTZB005抑菌活性相对较强，宿主中野生甘草总黄酮抑菌活性相对较强。见表2。

表2　对肺炎链球菌抑菌圈值表　　±s

注：JTYB为野生甘草内生细菌，JTYF为野生甘草内生真菌，JTZB为栽培甘草内生细菌，JTZF为栽培甘草内生真菌。与无菌水对比，**P<0.01；与野生甘草水煎液对比，##P<0.01；与栽培甘草水煎液对比，△△P<0.01；与野生甘草总黄酮对比，＊＊P<0.01；与栽培甘草总黄酮对比，▲▲P<0.01；与野生甘草总皂苷对比，□P<0.05；与栽培甘草总皂苷对比，■■P<0.01。

各有效菌株、水煎液、总黄酮、总皂苷对大肠杆菌均有抑菌活性(P<0.01)。与栽培甘草水煎液、栽培甘草总黄酮对比，JTZB018抑菌活性较强(P<0.01)。有效菌株中JTZB018抑菌活性相对较强，宿主中野生、栽培甘草总黄酮抑菌活性相对较强。见表3。

表3　对大肠杆菌抑菌圈值表　　±s

注：JTYB为野生甘草内生细菌，JTYF为野生甘草内生真菌，JTZB为栽培甘草内生细菌，JTZF为栽培甘草内生真菌。与无菌水对比，**P<0.01；与野生甘草水煎液对比，##P<0.01；与栽培甘草水煎液对比，△△P<0.01；与野生甘草总黄酮对比，＊＊P<0.01；与栽培甘草总黄酮对比，▲▲P<0.01；与野生甘草总皂苷对比，□P<0.05，□□P<0.01；与栽培甘草总皂苷对比，■■P<0.01。

2.2各有效菌株与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌的MIC

见表4。

表4　对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌的MIC(48h)测定表　　g·mL-1

续表4

注：“—”为无抑菌作用。

3讨论

实验中，从野生与栽培甘草中共分离出140株内生菌，由于菌株较多，无法全部发酵与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷进行体外抑菌活性对比研究；因此，先将140株内生菌经体外抑菌筛选有效菌种，体外抑菌实验可简单、快捷筛选出有效抑菌受试药物，能够准确、定量地得出供试品的抑菌强度，且不受内环境等多种因素的干扰，重现性好。筛选出20株有效菌种与甘草水煎液、总黄酮、总皂苷分别进行二次体外抑菌实验。结果表明：18株内生菌对金黄色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)，有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相对较强，最小抑菌浓度分别为0.125 0，0.062 5 g/mL。3株(JTZB005，043；JTZF014)对肺炎链球菌有抑菌活性(P<0.01)；与栽培甘草水煎液、总皂苷对比，JTZB005抑菌活性较强(P<0.01)，最小抑菌浓度0.062 5 g/mL。3株(JTYB012；JTZB018，020)对大肠杆菌均有抑菌活性(P<0.01)，与栽培甘草水煎液、总黄酮对比，JTZB018抑菌活性较强(P<0.01)，最小抑菌浓0.125 0 g/mL。结果提示：20株甘草内生菌对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌均有不同程度抑菌活性，在一定抑菌范围内甘草内生菌可替代甘草水煎液或甘草总黄酮、甘草总皂苷。

4参考文献

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[3]赵镭,师清芝,唐星.甘草中甘草酸和甘草苷的提取纯化工艺研究[J].中药工艺与制剂,2009,20(6):426-428.

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[5]刘霞,党峰峰,贺晓龙,等.陕北野生甘草内生菌的分离及抑菌活性筛选[J].西北植物学报,2010,30(10):2110-2115.

[6]邓毅,王艳,丁仁伟,等.甘肃甘草内生菌次生代谢产物抑菌活性初步研究[J].中药材,2013,36(2):181-184.

[7]李仪奎,金若敏,王钦茂,等.中药药理实验方法学[M].2版.上海:上海科技出版社,2006:755.

[8]余琼,白志川,孟德胜,等.23种中草药提取物对肺炎链球菌的抗菌作用研究[J].中国药房,2011,22(23):2135-2136.

(编辑陶珠)

文章编号:1001-6910(2016)05-0066-05·药学研究·

中图分类号:R284

文献标志码:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.05.33

通信作者：邓毅，教授，dengyi@gszy.edu.cn

* 基金项目：国家自然基金(81360633)

收稿日期：2016-01-03；修回日期：2016-03-14