陶凤

摘 要：壳聚糖是天然聚多糖甲壳素的脱乙酰产物，具有生物兼容性、生物降解性、无毒性。作为天然阳离子聚合物，壳聚糖具有正电性和特殊性能，因而壳聚糖及其衍生物可广泛用作药物和基因载体。但是其水溶性不好，单纯壳聚糖转染效率也不高，这就大大限制其应用范围。为了提高壳聚糖的溶解性和转染效率，对壳聚糖进行化学修饰极其必要。聚乙二醇能够有效提高水溶性，当其与药物相连时能增大分子量，减少肾消除延长半衰期，增加药物稳定性，并且PEG链包裹在药物表面，能够遮蔽药物的抗原，降低药物的免疫原性。我们通过合成了O-聚乙二醇单甲醚-N-马来酸酐-聚乙烯亚胺壳聚糖衍生物。合成的最终产物，不仅提高壳聚糖的水溶性和稳定性，提高转染效率，而且由于引入大量的活性氨基，则便于壳聚糖的进一步修饰。反应合成的中间体和最终产物都通过1HNMR和FTIR表征。

关键词：壳聚糖；基因载体；改性；聚乙二醇；聚乙烯亚胺

中图分类号：O636 文献标识码：A

壳聚糖是天然聚多糖甲壳素的脱乙酰产物，具有生物兼容性、生物降解性、无毒性。作为天然阳离子聚合物，壳聚糖具有正电性和特殊性能，因而壳聚糖及其衍生物可广泛用作药物和基因载体。但是其水溶性不好，则大大限制其应用范围。为此本课题通过对壳聚糖的修饰，旨在提高其水溶性。与此同时，壳聚糖作为基因载体，其转染效率也不太理想。为此我们也通过对壳聚糖的修饰，提高含氮量来提高转染效率。所以，通过修饰得到的壳聚糖衍生物水溶性好，转染效率高，稳定性好，免疫原性低，可作为更加理想的基因载体使用。

1 水溶性的PEI化壳聚糖的合成实验

在水溶性的PEI化壳聚糖的合成实验中主要使用的是分子量2000的聚乙二醇单甲醚，当聚乙二醇与药物相连时，能够增大药物的分子量，减少肾消除延长半衰期，增加药物稳定性，并且PEG链包裹在药物表面，能够遮蔽药物的抗原，降低药物的免疫原性。

1.1 实验合成路线

通过相关文献的查阅，为合成目标产物O-聚乙二醇单甲醚-N-马来酸酐-聚乙烯亚胺壳聚糖（mPEG-CS-N-MA-PEI），设计了如下的合成路线。首先完成碘代聚乙二醇单甲醚的合成，而后完成N-邻苯二甲酸酐壳聚糖的合成，再次依次完成O-聚乙二醇单甲醚壳聚糖的合成、O-聚乙二醇单甲醚-N-马来酸酐壳聚糖的合成、O-聚乙二醇单甲醚-N-马来酸酐-聚乙烯亚胺壳聚糖的合成等。

1.2 实验仪器及药品

1.2.1 实验仪器

NMR：Bruker AV400型核磁共振仪，真空泵（SHZ（Ⅲ）循环水式多用真空泵），FT-IR：Perkin-Elmer 2000型红外光谱仪（KBr压片），真空干燥箱（DZF-150型），加热搅拌器（DF-10B集热恒温磁力搅拌器），水泵（SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵），旋转蒸发仪（RE-5299），透析袋（截留分子量为8000-14000，北京索莱宝科技公司）。

1.2.2 实验试剂

壳聚糖：南京卫康生物制品有限公司，脱乙酰度>90%，分子量48KDa；聚乙二醇单甲醚（mPEG）：韩国Hannong化学公司，分子量2KDa；聚乙烯亚胺（PEI）：武汉强龙化工有限公司，分子量2KDa；马来酸酐：成都市科龙化工试剂厂，含量99.5%；亚磷酸三苯酯：成都市科龙化工试剂厂，含量98.0%；CH3I，DMSO，甲苯，乙醚，成都市科龙化工试剂厂。

1.3 实验步骤

1.3.1 碘代聚乙二醇单甲醚（mPEGI）的制备

称取10g MPEG加入50mL三颈烧瓶中，再加入1.3mL亚磷酸三苯酯和0.6mL碘甲烷，在氮气保护下，升温至120℃，搅拌下反应8h后停止。反应完毕后冷却至室温，抽滤，所得滤液搅拌下倒入冰水中析出浅棕色固体，滤饼用乙醇索氏提取，直到提取液近乎无色为止。所得产品放置在红外灯下干燥，碾碎得浅棕色粉末。产率：89%。

1.3.2 N-邻苯二甲酸酐壳聚糖的制备

称取5g壳聚糖和13.6g邻苯二甲酸酐加入200mL单颈瓶中，再加入100mL DMF，升温至130℃，搅拌条件下反应8h。反应完毕后冷却至室温，抽滤，所得滤液搅拌下倒入冰水中析出浅棕色固体，用乙醇洗涤两次，所得产品放置在红外灯下干燥，碾碎得浅棕色粉末。产率：92%。

1.3.3 O-聚乙二醇单甲醚壳聚糖的制备

称取1.5g邻苯二甲酸酐保护的壳聚糖，8g MPEGI和0.8g Ag2O加入到500mL三口瓶中，充入氩气，再加入90mL DMF，升温至60℃，搅拌下条件下反应16h后，再加入60mL水合肼和100mL蒸馏水，升温至90℃后接着再反应15h。反应完毕后冷却至室温，过滤，滤液浓缩，在滤液中加入硫酸钠分液，取上层黄色油状粗产物，装入透析袋中透析4天，减压浓缩，真空干燥，得浅色固體化合物。

1.3.4 O-聚乙二醇单甲醚-N-马来酸酐壳聚糖的制备

称取1.2g制备的O-聚乙二醇单甲醚壳聚糖加入100mL的三口瓶中，加入45mL DMSO充分溶解，然后加入0.9g马来酸酐，继续搅拌，升温至60℃，反应8h后停止。将装置改为减压蒸馏装置，蒸出大部分的溶剂DMSO，然后加入10mL的蒸馏水，倒入透析袋中透析3天，用旋转蒸发仪旋干后再减压抽干得0.7克白色固体。

1.3.5 O-聚乙二醇单甲醚-N-马来酸酐-聚乙烯亚胺壳聚糖的制备

称取0.5g已制备的mPEG-O-CS-N-MA溶于50mL蒸馏水中，然后加入250mL的三口瓶中，称取4.8g的PEI溶于70mL蒸馏水中，倒入恒压滴液漏斗中，升温至60℃，搅拌下将PEI溶液滴入三口瓶中，反应48h。反应结束后，用稀盐酸调节pH值至7，用旋转蒸发仪旋出大部分水后透析三天，然后旋干，再减压抽干得0.8g白色固体。

1.4 谱图及谱图分析

从实验数据中可以看出，壳聚糖的红外吸收为：1599cm-1（酰胺II，-NH2伸缩振动）和1383cm-1（酰胺III）处为壳聚糖的特征吸收峰。羟基中O-H的伸缩振动吸收峰和N-H的伸缩振动吸收峰在3442cm-1处。C-H伸缩振动吸收峰为2900cm-1和2873cm-1。1145cm-1为C-O-C弯曲振动吸收峰，仲羟基中C-O伸缩振动吸收峰为1093cm-1，1021cm-1为伯羟基中C-O伸缩振动吸收峰为。

合成后氨基被邻苯二甲酸酐保护后，壳聚糖氨基的伸缩振动吸收峰1599cm-1消失。同时，在1712cm-1、1777cm-1处出现邻苯二甲酰胺上羰基的特征吸收峰。而且，在720cm-1和795cm-1处出现苯环的摇摆振动特征吸收峰，说明氨基已经被邻苯二甲酸酐保护起来。

在聚乙二醇化壳聚糖的检测中发现邻苯二甲酰胺上羰基的特征吸收峰1712cm-1、1777cm-1消失，说明在水合肼中的作用下，邻苯二甲酰基已完全被脱去，氨基被释放出来。并且2886cm-1和1114cm-1左右的吸收峰的强度明显高于壳聚糖，这是由于接枝了mPEG后壳聚糖衍生物中亚甲基和醚键大量增加所致。

由红外谱图中的数据可知，聚乙二醇化壳聚糖接枝马来酸酐以后在1720cm-1出现了一吸收峰，这是接入马来酸酐后形成特征吸收峰，表明了马来酸酐成功接入壳聚糖。

通过测试数据表明，马来酸酐化壳聚糖与PEI发生迈克尔加成后，1720cm-1处吸收峰消失，说明壳聚糖衍生物上的双键与PEI的氨基发生反应。并且接枝PEI后引入了大量的氨基，所以在1600cm-1左右出现了氨基的特征吸收峰。这就表明PEI已经成功接枝到壳聚糖上形成预期的壳聚糖衍生物。

结语

为改进壳聚糖在基因载体方面的应用，提高壳聚糖的水溶性、稳定性、转染效率和降低免疫源性，本课题合成了O-聚乙二醇单甲醚-N-马来酸酐-聚乙烯亚胺壳聚糖衍生物，。合成的最终产物，不仅提高壳聚糖的水溶性和稳定性，提高转染效率，而且由于引入大量的活性氨基，则便于壳聚糖的进一步修饰。由红外谱图分析可知，6位羟基的mPEG和2位氨基的PEI已经接上，得到了预期的产物。并且由于PEI的引入，引入了大量有反应活性的氨基，如果要进一步修饰衍生物，比如靶向性的引入半乳糖或者叶酸，则更加容易进行。因此PEI的引入，为壳聚糖衍生物的进一步研究奠定了基础。实验结果表明，这种壳聚糖衍生物的水溶性很好，水溶性的改进达到了预期的效果。而由于时间的限制，此衍生物在轉染方面的测试还没来得及进行，还有待继续研究。

参考文献

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