罗睿雄　赵志常　黄建峰　党志国　高爱平

摘 要 采用3′RACE和RT-PCR技术克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全长cDNA序列，并用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式。结果表明：MiNDPK1基因cDNA全长1 019 bp，开放閱读框为447 bp，编码148个氨基酸。MiNDPK1蛋白定位于细胞质，无信号肽和跨膜区域，具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点；与麻疯树、橡胶树同源性最高为89%，与菠菜同源性最低为82%。MiNDPK1在芒果各组织中均有表达，以叶片中表达最高，其次是花和果皮；在芒果进入生殖时期的花芽分化期表达量最高，此后在芒果果实发育进程中逐渐降低并趋于平稳。结合病害处理转录组样本中的差异性表达结果，推测芒果MiNDPK1基因在花芽分化进程、抗病性诱导及免疫应答通路上发挥重要作用。

关键词 芒果；核苷二磷酸激酶；基因克隆；生物信息学分析；表达分析

中图分类号 S667.7 文献标识码 A

核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase，NDPK）是一种保守性多功能蛋白，其首要功能是依靠该酶上一保守的组氨酸残基介导催化二磷酸核苷（Nucleoside diphosphate，NDP）和三磷酸核苷（Adenosine triphosphate，ATP）之间的磷酸基团转移反应来维持生命体细胞内ATP和NTP等浓度的平衡[1]，参与UTP和GTP生物合成过程，在生物体新陈代谢方面起重要作用。NDPK蛋白由Berg等[2]于1953年发现以来，主要在人和动物领域研究较为深入，植物中研究较晚，但其普遍存在于原核、真核生物中，并多数以四聚体的形式存在于原核生物中，而在真核生物中却以六聚体形式存在；已有研究结果认为，NDPKs基因是一种古老基因，并以家族的形式存在，定位于细胞溶质、细胞核、线粒体及叶绿体中，是一种分泌蛋白。人类基因组中存在8个NDPKs基因（NDPKH1-NDPKH8），植物中发现的主要有NDPK1-4四个类型（拟南芥、水稻），而支原体等部分微生物不存在NDPKs基因，但多数物种存在至少一种NDPK基因[3]。

随着研究的深入，NDPKs被看作是一种“管家酶”，主要功能是维持NDP和NTP代谢平衡[1]。NDPK以其具有催化磷酸基团转移为基础的功能，在动物中不同细胞环境发挥特异性功能，起着控制细胞增殖、调控转录[4]、蛋白质磷酸转移[5-7]、DNA修复损伤[8]、细胞分化[9]、细胞的移动[10]、糖类和脂类代谢[11-12]等作用；而动物核苷二磷酸激酶家族中的2个重要成员NDPK-A和NDPK-B中的NDPK-A与肿瘤转移的关系更为密切，NDPK-A被认为通过多种作用机制抑制肿瘤转移，在乳腺癌、胰腺癌、肝癌和恶性黑色素瘤等癌症患者癌组织中的表达水平与癌组织的转移潜能呈负相关[13-16]，也用于肿瘤（NDKA）和结直肠癌（CRC）等病症的生物标志物[17]。在植物体上，NDPKs除在植物种子萌发、生长发育[18-19]、內源激素[20]、植物色素A/B[21]和烟草细胞凋亡[22]起调控作用外，还参与如盐害、低温[23]、高温[24]、干旱[25]、机械损伤[26]、热激[27]、紫外光照射[28]、氧化胁迫[29]、金属离子[30]、化学药剂（甲基紫罗碱和脱落酸等）[31-32]、病害[33]等生物与非生物碱胁迫的应答机制。此外，NDPKs也参与细胞信号转导[29，34]、乙烯信号转导[35]、保护防御相关基因的诱导表达[36]及响应光剌激等方面的作用。

芒果（Mangifera indica L.）是中国热带亚热带地区重要的经济作物，是世界第二大热带水果，素有“热带水果之王”的美称。芒果的热带属性导致芒果对逆境胁迫比较敏感，如开花期的低温阴雨天气，容易引起芒果授粉受精不良，座果率降低，也易导致病害的发生促使芒果大量腐烂[37]；干旱、盐等胁迫后易导致芒果果实变小、产量降低，从而影响品质[38]。本试验在芒果炭疽病样本转录组数据库中查找的差异性表达序列，经比对确认该片段为芒果核苷二磷酸激酶（NDPK）基因，根据片段序列设计3′RACE引物，并扩增3′端序列，经拼接比对分析，预测获得含开放阅读框的cDNA序列；进一步设计全长引物，然后PCR扩增获得准确全长基因序列，对其进行生物信息学和不同组织器官的表达模式分析，旨在为进一步探明芒果核苷二磷酸激酶基因的功能作用、调控逆境胁迫及免疫应答通路方面的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

参试芒果品种为贵妃芒，保存于海南省儋州市的农业部儋州芒果种质资源圃。选择生长一致的贵妃芒，采集芒果根、茎、叶、花、果，用于不同组织器官的表达分析；采集芒果从花芽分化期至果实成熟期之间不同时期组织材料，用于芒果果实发育过程中的表达分析。所有采集组织材料液氮速冻并于-80 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 提取芒果RNA，参照天根生化科技有限公司的RNAprep pure Plant Kit说明书进行，采用TAKARA的 3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase反转录获得3′RACE扩增cDNA模版，采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA模板，具体操作参照说明书进行。

1.2.2 NDPK1基因克隆 根据转录组数据序列片段，运用Primer 5设计3′RACE特异引物3′-GSP1、3′-GSP2；以拼接的cDNA序列设计MiNDPK1基因的全长特异引物MiNDPK1-F1、MiNDPK1-R1（表1）。以3′RACE cDNA模板扩增NDPK1基因3′端序列，使用上游外侧特异性引物（3′-GSP1）和3′RACE Outer Primer进行1st PCR反应。如果1st PCR反应未能得到目的产物，再使用上游内侧特异性引物（3′-GSP2）和3′RACE Inner Primer进行2nd PCR反应。 外侧PCR反应体系设置为：cDNA模板2 μL，1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ 2 μL，3′RACE Outer Primer和3′-GSP1引物各（10 μm） 2 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+）4 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，LA Taq（5 U/μL）0.25 μL，补足水至总体积为50 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共25个循环；72 ℃ 10 min；第二轮PCR反应则以第一轮PCR产物稀释50倍后，取2 μL作为模版进行第二轮PCR扩增，除引物更换为内侧引物外，其余体系同第一轮PCR，PCR反应程序同第一轮，但循环数改为30个循环。PCR结束后，取 5～10 μL的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3′RACE PCR扩增产物，再进行回收纯化，连接到pMD18-T克隆载体上并转化至感受态的DH5α大肠杆菌中，涂板培养，挑取单克隆经菌液PCR验证获得阳性单克隆送往英俊公司测序。

1.2.3 MiNDPK1基因生物信息学分析 采用NCBI ORF Finder查找基因开放阅读框ORF，采用DNAMAN软件推导氨基酸序列；采用CLUSTA W进行NDPK1氨基酸多重序列比对；采用MEGA6构建不同物种NDPK1蛋白氨基酸系统进化树；采用NCBI BlastP对芒果MiNDPK1基因的氨基酸序列进行比对分析；使用ProtParam在线预测MiNDPK1蛋白理化性质；使用Subloc v1.0在线亚细胞定位；采用SMART和Motif Scan、Scanprosite在线分析蛋白功能结构域；利用SOPMA在线预测NDPK1的二级结构；

1.2.4 MiNDPK1基因的表达分析 根据获得的芒果NDPK1基因序列设计荧光定量引物MiNDPK1-F2、MiNDPK1-R2；以芒果Actin1肌动蛋白基因设计内参引物Actin-F、Actin-R（表1）。实时定量PCR在Thermo PikoReal上进行，PCR反应体系为10 μL，具体参照TAKARA公司SYBRTMTPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明书进行。PCR扩增程度为：95 ℃ 7 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；实验设置3次生物学重复，数据采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。

1.3 数据统计与分析

数据处理与图标制作采用Excel 2013和DPS7.05统计软件，差异显著性分析采用Ducan新复极差法。

2 结果与分析

2.1 MiNDPK1基因克隆

以芒果总RNA反转录的3′RACE cDNA为模板扩增芒果NDPK基因的3′端序列，得到500 bp的条带（图1-A），经回收、纯化、亚克隆，将阳性单克隆送样测序后，获得序列与转录组获得的原序列片段拼接。以拼接的序列设计全长特异引物扩增获得含ORF的全长编码序列，约为450 bp（图1-B），经NCBI比对，确认获得含有ORF的芒果核苷二磷酸激酶基因全长cDNA序列，命名为MiNDPK1。其cDNA全长1 019 bp，5′-UTR长度为348 bp，3′-UTR长度为224 bp，且含有16 bp的ployA尾巴，完整开放阅读框ORF全长为447 bp，编码148个氨基酸（图2）。

2.2 MiNDPK1基因生物信息学分析

2.2.1 MiNDPK1同源性分析 采用NCBI BlastP对芒果MiNDPK1基因的氨基酸序列进行比对分析，结果表明，芒果MiNDPK1与其他物种的氨基酸序列同源性在82%～90%，其中与麻疯树Jatropha curcas（ADB85102）、橡胶树Hevea brasiliensis（ADR30796）、木薯Manihot esculenta（OAY49435）同源性最高为89%，与菠菜Spinacia oleracea（KNA14344）同源性最低为82%。不同物种NDPK氨基酸序列同源性均高达82%以上，结合由Clustal W多重序列比对结果（图3），说明NDPK1蛋白在进化上的高度保守性。进一步用MEGA6.0软件将芒果MiNDPK1与其他物种的25个NDPK蛋白构建系统进化树（图4），芒果与毛果杨Populus trichocarpa（ABK95604）、风信子Hyacinthus orientalis（AAT08712）、可可树Thebroma cacao（EOX96493）、野山茶Camellia sinensis（AEC10975）、橡胶树、木薯等聚为一大类，形成木本植物中热带亚热带植物较近的亲缘关系。而与花生Archis hypogaea（AAZ20283）、大豆Glycine max（ACU14249）、玉米Zea mays（DAA46325）等草本植物亲缘关系较远。由此，利用同源基因的进化距离可明显区分各科属间的进化关系。

2.2.2 MiNDPK1基因编码蛋白的理化性质分析

使用ProtParam在线分析结果表明，MiNDPK1蛋白分子式为C748H1 163N195O213S5，相对分子质量为16.45 ku，等电点为6.58，正电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为18，负电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为17；脂肪系数为86.22，总平均疏水性为-0.142，不稳定系数为29.53，是稳定蛋白；亚细胞定位于细胞质（RI=9），无信号肽，也不存在跨膜区域。经过SMART和Scanprosite软件在线分析，MiNDPK1编码氨基酸中第2～136为典型核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinases）活性结构域，76～79、83～86为酰胺化位点，43～46为酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，12～17、99～104为N端肉蔻酰基化位点，31～33、53～55、83～85、100～102为蛋白激酶C磷酸化位点，102～104为细胞连接序列，42～49为酪氨酸激酶磷酸化位点，112～120为核苷二磷酸激酶活性位点。利用SOPMA在线预测NDPK1蛋白的二级结构，结果显示，42个α-螺旋占28.38%，43个随机卷曲占29.05%，41个延伸链占27.70%，22个β-转角占14.86%。

2.3 MiNDPK1基因的表达分析

2.3.1 MiNDPK1基因在不同组织器官中的表达分析 检测芒果不同组织器官中MiNDPK1基因的表达量，结果表明，MiNDPK1基因在根、莖、叶、花、果实等器官中均有表达，其中在叶中表达量最高，其次是果皮和花，在茎和种子中的表达量最低（图5）。

2.3.2 MiNDPK1基因在不同生长发育时期的表达分析 根据芒果MiNDPK1基因在不同生长发育阶段的表达模式分析可知，MiNDPK1基因在芒果花芽分化期表达量最高，其后进入花期迅速下降，下降幅度为66.59%，进入果期后在种子发育过程中平稳表达（图6）。

3 討论与结论

NDPK1蛋白是属于NDPK家族蛋白之一，布于真核、原核生物中。动物中主要有平衡细胞内ATP和NTP浓度及其抑制肿瘤转移的功能[1，13-15]。在植物中存在调控植物生长发育、逆境胁迫应答、病虫害感应等作用[26，30，33，36]。目前，已经从菠菜Spinacia oleracea（KNA14344）[39]、拟南芥Arabidopsis thaliana（AEE82742）[40]、烟草Nicotiana tabacum（AAZ85394）[41]、豌豆Pisum sativum（BAA12982）、嗜冷假交替单胞菌Psychrophilic Pseudoalteromonas sp.[42]等物种中克隆到NDPKs基因。本实验首次从芒果叶片中克隆到MiNDPK1基因的cDNA序列，全长1 019 bp，开放阅读框477 bp，编码148个氨基酸，定位于细胞质中，该蛋白不具有信号肽和跨膜区域，说明其不存在膜受体功能，亦不能定位于膜的锚定蛋白或离子通道等，这与其他如甘蔗[25]等物种NDPK1基因具有相似的结构功能。另外，该蛋白含有酪蛋白激酶ii、蛋白激酶C、酪氨酸激酶，特别是核苷二磷酸激酶等多个磷酸化活性位点，使得NDPK1蛋白可通过磷酸化与去磷酸化调控细胞内相关酶活性功能，并使之对外界刺激产生迅速的反馈调节。这表明NDPK1具有重要的化学反应催化功能及其调控植物响应逆境胁迫的作用机制。NDPK1的进一步深入研究将有助于揭示其生物学特性并开发可能存在的农业应用价值。

已有研究结果表明，植物胞质中的NDPK1是NDPKs的主要存在形式，占NDPKs总活性的70%以上，几乎分布于根尖叶片、块茎等所有再生组织中[43]。本实验对芒果MiNDPK1基因在不同组织器官表达量分析结果表明，MiNDPK1在根、茎、叶、花、果实等器官中中均有表达，其中在叶中表达量最高，其次为果皮，这可能是因NDPKs能够结合植物光敏色素的红激发形式提高自身活性功能，参与植物光敏色素的信号转导途径[20]及通过调控其他相关基因的转录水平进而影响叶绿体发育和叶绿素的生物合成[44]有关，表明NDPKs对植物光合作用起到关键作用。其在芒果花芽分化期的高表达量也印证了NDPKs主要分布于根尖、叶片等再生组织，并在植物早期生长和分化阶段发挥作用的观点[31]，与Galvis等[45]研究豌豆MtNDPK基因在幼嫩叶片及花蕾生殖器官表达量高于其他组织器官的结论一致。

NDPK1也参与植物伤害、热休克、低温、干旱、盐、金属离子和化学药剂等逆境胁迫应答，并起到正向调控的作用[25-29，32，46-47]，胁迫消失后应答终止[27]。如干旱处理甘蔗幼苗和鹰嘴豆茎后NDPK基因均表达上调[25，48]；NDPK还可诱导冷胁迫相关基因pBC442、病程相关蛋白基因OsPR2a、氧化胁迫相关蛋白基因POD、CAT、OsPR4等保护防御相关基因或参与细胞信号传导相关基因的表达[36，46，49]。本试验所用序列片段亦是从芒果病害转录组样本差异基因中获得，预示芒果MiNDPK1也可能参与芒果病害的响应或调控其他抗病相关基因的表达而提高其抗病能力。但具体的抗病机理和调控机制还需深入到蛋白质组水平上研究才能予以明确。

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