王 菁， 牛从从， 王 辉， 郇 丽（. 山东省青岛第五十八中学， 山东 青岛 6600； . 中国科学院海洋研究所， 山东 青岛， 6607）



细胞的氧化还原状态对浒苔孢子囊形成的影响

王 菁1， 牛从从1， 王 辉2， 郇 丽2
（1. 山东省青岛第五十八中学， 山东 青岛 266100； 2. 中国科学院海洋研究所， 山东 青岛， 266071）

浒苔（Ulva prolifera）是我国黄海海域绿潮暴发的主要成因种， 其孢子囊的形成和孢子的释放是浒苔大量、快速增殖的基础。本文以浒苔为研究材料， 比较分析了还原剂（DTT）和氧化剂（H2O2）对直径为1 mm的圆形藻片从营养细胞形成孢子囊过程的影响。研究结果表明， DTT对浒苔孢子囊的形成具有明显的抑制作用， 用H2O2处理的浒苔藻片与对照组相比没有显著性的差异， 因此浒苔细胞处于还原状态时不利于孢子囊的形成。研究结果为探究浒苔孢子形成的调控机制提供了科学依据。

浒苔； 孢子囊； DTT； H2O2

［Foundation： Strategic Leading Science and Technology Projects of China. Academy of Sciences（XDA11020404）； National Natural Science Foundation of China （41176137）］

自2007年至今， 由浒苔引发的绿潮在我国黄海海域连续多年周期性爆发， 造成了严重的经济损失，恶化了海洋环境和旅游景观， 引起了社会的广泛关注。2008年在青岛近海海域形成的大面积漂浮浒苔严重影响了青岛奥运会帆船、帆板比赛的顺利进行。据报道， 2008年绿潮爆发时其生物量超过1000万t， 在青岛至少打捞了150万t的浒苔藻体［1-2］。为此， 当地政府耗费了大量的人力、物力和财力对其进行清除。在2007年以前， 青岛近海乃至国内其他海域很少发生绿潮现象， 因此相关研究报道较少。尽管近年来政府和研究者对绿潮高度关注， 但主要集中在绿潮原因种浒苔的溯源研究、生物活性物质分析上［3-4］， 对浒苔的生物学特性， 尤其是孢子囊形成过程的研究相对较少。

浒苔的繁殖方式主要分为3种类型： （1）单性生殖，即雌雄配子体释放的配子附着后， 分别发育成新的配子体， 无需相互结合形成合子， 甚至有的配子不放散出来原位生长发育； （2）有性生殖， 即放散的雌雄配子结合形成合子， 合子附着后发育成孢子体， 成熟后释放的孢子再发育成配子体， 孢子体世代与配子体世代在形态上无显著差异， 其生活史为同型世代交替； （3）无性生殖， 即孢子体释放的孢子附着后直接进行生长发育［5］。当绿潮爆发时， 浒苔的主要繁殖方式为无性生殖， 即营养细胞首先形成孢子囊， 然后释放孢子， 进而发育形成新的藻体。因此， 研究浒苔的增殖过程应聚焦在孢子囊的形成过程及其孢子的释放和萌发。

据报道， 细胞光合电子传递链的氧化还原状态影响孢子的形成和发育过程， 如蓝藻藻殖段的形成受光合电子传递链上质体醌氧化还原状态的调控［6］，质体醌的氧化还原状态与细胞的氧化还原状态密切相关。在高等植物中， 细胞的氧化还原状态影响其生长发育过程［7］。浒苔是孢子植物， 其营养细胞极易形成孢子囊， 那么浒苔细胞的氧化还原状态是否会调控其孢子囊的形成过程？

为此， 本文以黄海绿潮主要成因种浒苔为材料，使用还原剂和氧化剂改变细胞的氧化还原状态， 观察其对浒苔孢子囊形成的影响， 研究结果为探究浒苔孢子囊形成的调控机制提供了科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料的采集与培养

浒苔藻体采集于青岛市沿岸潮间带（36°03′14″N，120°22′17″E）。采集后快速转入实验室培养。藻体用灭菌海水反复清洗以去除杂质、小的浮游动物以及其他杂藻， 然后培养在灭菌海水中。

1.2 实验材料的处理

选择生理状态健康、藻体生长发育基本同步的浒苔作为实验材料。用打孔器将藻体打成直径为1 mm的圆形藻片， 在灭菌海水中进行培养。前期实验发现1 mm藻片在光照强度为40 µmol /（m2·s）（L： D=12：12）， 温度为20℃的条件下培养60 h后营养细胞即形成孢子囊并释放孢子， 且同步性良好， 故选取此培养条件进行本实验。

1.3 显微镜观察

藻片培养期间在显微镜（Leica DM 2500， 德国）下观察其孢子囊形成情况， 并依据藻片内有无孢子囊形成为标准， 计算孢子囊形成率。

1.4 还原剂对浒苔孢子囊形成的影响

选用常见的强还原剂二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）作为还原剂， 使细胞处于还原状态。1 mm圆形藻片用正常灭菌海水培养36 h后， 在培养基中添加DTT至终浓度为2 mmol/L。继续培养24 h后进行显微观察， 并计算形成孢子囊藻片的比例。

另外， 藻片用DTT处理24 h后， 用灭菌海水反复冲洗去除DTT， 然后在正常的海水中继续培养48 h后再次观察其孢子囊形成状况， 计算形成孢子囊藻片的比例， 并与以上结果进行比对分析。

1.5 氧化剂对浒苔孢子囊形成的影响

以合适浓度的过氧化氢（Hydrogen Peroxide，H2O2）作为氧化剂， 使细胞处于氧化状态。1 mm圆形藻片用正常灭菌海水培养36 h后， 在培养基中添加H2O2至终浓度为0.2 mmol/L。继续培养24 h后对藻片进行显微观察， 并计算形成孢子囊藻片的比率。

2 结果

2.1 正常培养藻片的孢子囊形成与孢子释放情况

藻片在培养起始时（0 h）全部为营养细胞（图1A），培养48 h后， 藻片依然为营养细胞， 与起始时相同，细胞结构基本没有发生显著变化（图1B）。继续培养12 h（总培养时间60 h）， 期间大部分圆形藻片开始形成孢子囊， 部分孢子囊开始释放孢子（图1C）。培养60 h后， 形成孢子囊的藻片比率约为84%（表1）。

图1 正常培养条件下不同时间段浒苔藻片孢子囊的形成情况Fig. 1 The formation of Ulva prolifera sporangia after various lengths of time under normal culture conditions

表1 不同处理条件下浒苔藻片形成孢子囊的藻片比率Tab. 1 The percentage of sporangia that formed on Ulva prolifera disks under different treatments

2.2 DTT对浒苔孢子囊形成的影响

正常培养36 h后的藻片置于终浓度为2 mmol/L DTT的培养液中继续培养， 12 h后（总培养时间为48 h）进行显微观察。从图2A可以看出， 藻片与正常条件下培养的藻片无显著差别。在2 mmol/L DTT的培养液中培养24 h后（总培养时间为60 h）， 大部分藻片仍然处于营养细胞状态， 很少有藻片形成孢子囊（图2B）， 形成孢子囊的藻片比率仅约为11.3%（表1）。

将在2 mmol/L DTT的培养液培养24 h后的藻片挑选出来， 去除DTT后继续培养， 发现在去除DTT培养48 h（总培养时间为108 h）后大部分藻片又形成了孢子囊， 形成孢子囊的藻片比率约为80.5%。

2.3 H2O2对浒苔孢子囊形成的影响

选取正常培养36 h后的藻片添加终浓度为0.2 mmol/L的H2O2， 继续培养12 h后进行显微观察，发现藻片细胞与同期正常培养的圆形藻片无显著差别（图3A）。再继续培养12 h（总培养时间为60 h）后，同正常培养组类似， 表现为大部分藻片形成孢子囊并伴随孢子释放（图3B）， 形成孢子囊的藻片比率约为78.9%（表1）。

图2 在培养液中添加终浓度为2 mmol/L DTT时， 不同时间段浒苔藻片孢子囊的形成情况Fig. 2 The formation of Ulva prolifera sporangia following various lengths of exposure to dithiothreitol （DTT）

图3 在培养液中添加终浓度为0.2 mmol/L H2O2时， 不同时间段浒苔藻片孢子囊的形成情况Fig. 3 The formation of Ulva prolifera sporangia following various lengths of exposure to H2O2

3 讨论

多种因素可以促进浒苔孢子囊的形成和孢子的释放。Wang等［8］研究发现高盐和高光等胁迫因子可以促进浒苔孢子囊的形成。Gao等［9］将浒苔藻体分成不同孔径大小的圆形藻片， 观察其孢子囊的形成和孢子的放散情况， 发现直径小于1 mm的藻片最适合于孢子囊的形成， 释放的孢子可正常发育成新的藻体。在自然条件下， 丝状的浒苔藻体可能由海浪冲击和螺旋桨等机械作用产生不同大小的碎片， 动物滤食也会产生碎片， 尤其食藻动物排出的粪便中含有大量的未完全消化的藻片［10］。这些藻片在合适的条件下都会形成孢子（配子）囊。正因如此， 作者选择了1 mm的藻片作为实验材料， 研究孢子囊的形成和孢子的释放过程。

通过对比分析含有DTT的培养液中的藻片和不含有DTT的正常培养液中的藻片， 发现DTT可以明显抑制藻片孢子囊的形成。DTT可以使细胞处于还原状态， 我们推测光合电子传递链上的质体醌也因此处于还原状态， 由此影响了光合电子的传递， 进而影响了孢子囊的形成； 当去除DTT时， 圆形藻片可以继续形成孢子囊， 表明这种抑制作用是暂时性的。以上结果与以蓝藻作为材料的结果基本一致［6］。

含有H2O2的培养液中的藻片与不含有H2O2的正常培养液中的藻片进行比较分析， 发现两者均可形成孢子囊并伴随着孢子的释放， 没有显著性差异。究其原因， 作者认为与完整藻体相比， 直径为1 mm的藻片由于机械损伤也是处于逆境状态。一般认为，处于逆境状态的组织可以产生活性氧［11-13］， 营养细胞因此处于氧化状态， 所以极易形成孢子囊。与添加有DTT的培养液中的藻片相比， 培养在含有H2O2的藻片极易形成孢子囊， 可能与细胞的氧化状态有关。

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（本文编辑： 张培新）

The effect of cellular redox state on the formation of Ulva prolifera sporangia

WANG Jing1， NIU Cong-cong1， WANG Hui2， HUAN Li2
（1. Qingdao No.58 High School Shandong Province， Qingdao 266100， China； 2. Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266071， China）

Oct.， 10， 2015

Ulva prolifera； sporangia； DTT； H2O2

Outbreaks of Ulva prolifera cause green tides in the Yellow Sea of China. The rapid mass reproduction that is associated with these outbreaks is dependent on the formation of sporangia and the release of spores. In this study， the effect of oxidizing （H2O2） and reducing （dithiothreitol； DTT） agents on sporulation was investigated using 1-mm-diameter disks of U. prolifera. The results suggested that the application of DTT significantly inhibits the sporulation of this species， while there was no significant difference between the H2O2treatment and the control. Therefore， the creation of a reduced environment inhibits sporulation from vegetative cells. This information will be useful for further research into the regulation of sporulation in U. prolifera.

Q418

A

1000-3096（2016）01-0064-04

10.11759/hykx20151227002

2015-10-10；

2015-11-20

中国科学院战略性先导科技专项（XDA11020404）； 国家自然科学基金面上项目（41176137）

王菁（1997-）， 女， 山东青岛人， E-mail： jzgily@126.com；郇丽， 通信作者， 电话： 0532-82898575， E-mail： huanli2014@163.com