孙云霞　张先正

(武汉大学化学与分子科学学院，生物医用高分子材料教育部重点实验室，武汉430072)



阳离子寡肽序列的合成及生物学研究
——推荐一个针对化学生物学专业学生的研究型实验

孙云霞*张先正

(武汉大学化学与分子科学学院，生物医用高分子材料教育部重点实验室，武汉430072)

摘要：采用多肽固相合成技术制备了寡肽序列RRRRRRRR(R8)。通过电喷雾电离质谱仪对序列的相对分子质量进行了表征。进一步通过琼脂糖凝胶电泳和细胞内吞实验考察寡肽序列在生物学研究方面的应用。本实验可以加深学生对有机化学、高分子化学及生物化学的理解与运用，培养学生分析问题和解决问题的综合能力。

关键词：氨基酸；寡肽；多肽；凝胶电泳

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寡肽是由十种以下具有不同物理和化学性质的天然氨基酸通过肽键组成，由十种以上一百种以下氨基酸组成的称为多肽[1]。寡(多)肽由于其特有的生物活性、生物可降解性和良好的生物相容性而引起生物医学应用研究的广泛关注，尤其在基因传递、组织工程及细胞培养等方面。由于天然氨基酸分别具有不同的理化性质，通过调节寡(多)肽的序列，可制备出具有不同生理活性和生物功能的寡(多) 肽[2]。本实验通过多肽固相合成技术合成了阳离子寡肽序列，并初步研究了其作为基因传递系统的基本条件。

基因传递系统又称为基因载体，是可以携带DNA进入细胞的材料。传统的基因载体主要是病毒载体。由于病毒载体携带的DNA大小有限，而且病毒载体能引起免疫原性反应、致癌性以及能任意地整合到主体的基因组当中，存在着很大的安全隐患[3,4]。与病毒载体相对应的非病毒基因载体无传染性，安全隐患较小，而且成本较低，可以大量制备，重现性也较好。非病毒载体一般包括裸DNA、脂质体、阳离子高分子聚合物，其中脂质体又分为阳离子、阴离子及中性脂质体。阳离子脂类通过静电作用与DNA形成脂质体/DNA复合物(lipoplex)。常用的阳离子高分子聚合物包括天然高分子聚合物和合成高分子聚合物，天然高分子聚合物主要有壳聚糖及其衍生物[5,6]，合成聚合物主要有聚赖氨酸[7,8]、聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)[9,10]、树形高分子(dendrimer)等[11]。脂质体和阳离子高分子非病毒载体也存在着一些缺点，例如，缺乏靶向特异性、转染效率低、毒性较高、血清存在时不稳定等[12]，直接限制了它们在临床的应用。为了克服传统非病毒基因载体的缺点，本文利用天然氨基酸的优点制备了具有细胞穿膜功能的寡肽序列R8。

本实验针对化学系大学四年级化学生物学专业的学生开设，化学生物学专业共有学生约18人，以每三个学生为一组协作进行实验。该实验融合了基础有机化学、仪器分析化学以及生物学等知识，作为本科生综合实验，可以使学生较早地接触前沿科学，了解化学专业不再是一个单调、乏味的学科，而是一个与生物、物理、材料等学科交叉的前沿性学科，是一个很有发展前景的学科。

1　实验目的

(1)掌握多肽固相合成技术的原理和操作方法。

(2)熟悉电喷雾电离质谱仪(ESI-MS)的操作方法。

(3)了解凝胶电泳的一般原理并掌握凝胶电泳等基本生物实验操作。

2　实验原理

寡(多)肽是不同氨基酸从C端(羧基端)向N端(氨基端)直接通过肽键连接而成。过去的寡(多)肽合成一般是在溶液中进行的，称为液相合成法。为了提高产品的纯度和降低合成难度，发展了固相合成技术。固相合成是在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知顺序(序列，一般从C端-羧基端向N 端-氨基端)不断添加、反应、合成，最终得到寡(多)肽[13]，多肽合成的流程图如图1所示。本实验采用固相合成技术合成了细胞穿膜肽R8，利用电喷雾电离质谱仪对产物结构进行了鉴定，并通过凝胶电泳实验考察了R8作为基因载体的基本条件。

在阳离子寡(多)肽中，氨基基团的正电荷与DNA的磷酸根基团的负电荷通过静电吸附作用而发生电性中和，与DNA自组装成稳定的复合物(complexes)，使DNA不易被核酸酶降解。R8与DNA形成的复合物主要通过非特异性的细胞内吞方式进入细胞，包括网格蛋白介导性内吞(clathrin-mediated endocytosis)、细胞膜穴样内陷(caveolae-mediated endocytosis)、大分子胞饮内吞(macropinocytosis) 等[14,15]。R8与DNA复合物进入细胞后形成内涵体，复合物从内涵体中快速逃逸进入细胞质，进而扩散进入细胞核进行基因表达。

3　实验仪器及药品

3.1药品

氨基以及侧基的胍基分别被9-芴甲氧羰基和2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5-磺酰基保护的精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)、苯并三氮唑-N,N,N′N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)以及2-氯-三苯甲基氯树脂(2-chlorotrityl chloride resin，100－200目，负载量：1.2 mmol∙g－1)、哌啶(piperidine)、三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)、吗啡啉、茚三酮，分析纯。二异丙基乙胺(DIEA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷，化学纯。荧光素酶质粒pGL-3 DNA在E.Coli JM109大肠杆菌中扩增，质粒的提取和纯化使用Qiagen endotoxin-free plasmid Gigaprep试剂盒，通过去内毒素质粒纯化过程完成。人源宫颈癌细胞(HeLa)购于中国典型培养物保藏中心(武汉)。DMEM细胞培养基干粉、胰蛋白酶、胎牛血清购于Gibco。

图1　多肽固相合成流程图

3.2仪器

多肽合成玻璃柱，电喷雾电离质谱仪(ESI-MS)，琼脂糖凝胶电泳仪，电泳成像仪，细胞培养箱，生物安全柜，激光共聚焦显微镜。

4　实验过程

4.1多肽序列的合成及表征

(1)参考文献方法[16,17]，称取1.5 g 2-氯-三苯甲基氯树脂(负载量：1.2 mmol∙g－1)至多肽合成装置，加入10 mL干燥的DMF浸泡树脂数小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂DMF。

(2)称取2.34 g(3.6 mmol) Fmoc-Arg(Pbf)-OH于称量瓶中，用10 mL DMF将其溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入3.3 mL催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温下让Fmoc-Arg(Pbf)-OH与树脂相互作用约1.5 h，使其充分固定在树脂上。

(3)用4×10 mL DMF洗涤树脂。

(4)加入13 mL 50%吗啡啉/DMF(体积比)溶液到上一步的树脂中，反应2 h，脱去Arg上的Fmoc保护基。

(5)用4×10 mL DMF洗涤树脂，用茚三酮检验脱保护是否完全。

(6)称取2.34 g(3.6 mmol) Fmoc-Arg(Pbf)-OH，1.8 g(4.752 mmol) HBTU，0.64 g(4.752 mmol) HOBt于称量瓶中，用10 mL DMF溶解，将该溶液转入到上步处理后的多肽合成装置中，再加入2 mL DIEA，缩合反应1.5 h。

(7)用4×10 mL DMF洗涤树脂。

(8)加入13 mL 50%吗啡啉/DMF(体积比)溶液到树脂中，反应2 h，脱去Asp上的Fmoc保护基。

(9)用4×10 mL DMF洗涤树脂，用茚三酮检验脱保护是否完全。

(10)依次分别称取6次等量Fmoc-Arg(Pbf)-OH 2.34 g(3.6 mmol)，分别重复步骤6－9。

(11)用4×10 mL CH2Cl2洗涤树脂，充分洗干，于真空干燥箱中干燥24 h。

(12)脱侧基保护基(Pbf)，切落多肽：将25 mL TFA，0.6 mL乙二硫醇，2 mL苯酚，1.3 mL H2O，1.3 mLTIS，1.3 mL苯甲硫醚的混合液加到干燥后的树脂中，反应2 h。

(13)收集滤液TFA，用少量TFA洗树脂，收集洗液，合并滤液和洗液，用适量的无水乙醚进行沉淀，静置。沉淀充分后，抽滤，洗涤，干燥，得产品R8，用电喷雾电离质谱仪(ESI-MS)检测多肽的相对分子质量。ESI-MS检测的单电荷分子离子峰[M+H]+= 1268.5，计算得到的相对分子质量与理论分子质量(M = 1267.5)相吻合。寡肽序列的ESI-MS图谱如图2所示。

图2　R8寡肽序列ESI-MS图谱

4.2生物学研究

4.2.1琼脂糖凝胶的制备

(1)分别称取140 mg琼脂糖干粉、量取400 μL的TAE(Tris-醋酸)缓冲溶液和2 μL的GelRedTM染料，置入50 mL的锥形瓶中，加入20 mL的去离子水。然后将锥形瓶放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解。

(2)待溶液冷却至65°C后，倒入制胶板中冷却静置30分钟。

(3)待胶完全凝固好后加入电泳槽中备用。

4.2.2R8/DNA复合物的制备

称一定量的R8粉末溶在150 mmol∙L－1的NaCl溶液中配成0.4 mg∙mL－1的溶液，用220 nm的滤膜过滤灭菌。量取1.0µL DNA的TE溶液(100 ng∙µL－1)加入0.5 mL的无菌离心管中，按照不同的N/P比(R8上胺基的物质的量与DNA上磷酸根的物质的量之比)加入不同体积的R8溶液与DNA混合，最后补加一定体积的150 mmol∙L－1的NaCl溶液使总体积达到10.0µL。将10.0µL的混合液震荡5 s后在37°C下静置30 min后备用。

4.2.3凝胶电泳实验

在37°C下静置30 min后，在复合物中加入1.0µL溴酚蓝溶液。随后将N/P比分别为0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12的R8/DNA复合物加入含2.0µL GelRedTM染料的0.7% (g∙mL－1)的琼脂糖凝胶中进行电泳实验。电泳在80 V电压下的Tris的醋酸溶液中进行80 min，然后在凝胶成像仪(vilber lourmat)下通过紫外照射成像观察。

阳离子对DNA的络合能力是考察其作为载体的一个首要条件。阳离子载体与DNA通过静电作用形成紧密络合体，络合体在进入细胞后可避免被细胞内的酶降解，从而可以顺利地由内涵体逃逸到细胞质再进入细胞核内进行表达[18]。由图3可看出，R8/DNA复合物在N/P比为6时，DNA被完全络合。

图3　R8与DNA形成复合物的琼脂糖凝胶电泳结果

4.2.4复合物跨细胞膜实验

在复合物跨膜实验中，用绿色荧光探针YoYo-1标记DNA，用蓝色荧光探针Hoechst 33258标记细胞核。HeLa细胞以1×105个/孔的密度种到25 mm直径的培养皿中，在培养箱中培养24 h。随后，吸弃旧培养基，加入R8/DNA复合物(N/P比为10)，在培养箱内共同培养4 h。然后吸弃含复合物的旧培养基，用1 mL PBS淋洗细胞三次。将20µL Hoechst 33258(10 μg∙μL－1)加入200µL DMEM，混匀后加入培养皿中，在培养箱内孵育20 min。20 min后弃去皿内液体，用1 mL PBS淋洗细胞三次，加入1 mL新鲜的DMEM(含10% FBS)。将培养皿放在激光共聚焦显微镜下观察并拍照(波长为488 nm 和405 nm，放大倍数为40×)。复合物4 h后部分跨过细胞膜进入细胞质，部分分布在细胞核周围。共聚焦显微镜拍摄的复合物跨膜结果如图4所示。

5　实验安排及建议

(1)本实验需要的时间为24课时，分3天完成，其中R8序列的合成需要16课时连续两天完成，R8序列的结构、相对分子质量表征以及凝胶电泳实验需要8课时一天内完成，建议将本实验作为学生的综合实验进行。

图4　R8/DNA复合物跨膜过程

(2)考虑到细胞培养及操作实验需要无菌条件，建议将R8/DNA复合物跨膜的细胞内吞实验作为学生的业余科研内容，对复合物跨膜过程感兴趣的学生可以到教师的研究课题组中进行实验。

(3)实验前需要学生查阅多肽合成及细胞生物学等相关知识。要求学生学习巩固大学三年级学习的电喷雾电离质谱、凝胶电泳成像仪的操作。

(4)实验针对大学四年级化学生物学专业学生开设，实验人数共18人，每3个人一组，分6组进行实验。要求组内成员合理分工，协作完成实验。

(5)实验完成后，实验报告以研究性论文格式提交，要求对实验结果进行讨论和总结。

6　思考题

(1)多肽固相合成的基本原理是什么？

(2)氨基酸、多肽及蛋白质的区别？

(3)多肽固相合成过程中茚三铜的作用是什么？

7　实验注意事项

(1)寡肽合成所用的DMF要先加无水硫酸镁干燥，过滤后减压蒸馏，收集备用。

(2)凝胶电泳实验中使用GelRedTM染料时注意不能接触到口、鼻和皮肤，做好的凝胶不能直接用手接触，要带医用手套操作。

(3)实验完毕后清洗寡肽合成的玻璃柱。

(4)细胞实验要在生物安全柜中进行，实验前要带医用手套，穿干净实验服。所有从外面放入生物安全柜的用品要喷医用酒精消毒。应避免YoYo-1和Hoechst 33258荧光染料接触皮肤。

8　实验特色和效果

本实验综合基础有机化学、高分子化学、材料化学、生物化学及仪器分析等实验的原理和操作方法，是集合成与表征为一体的综合性较强的实验。该实验的设计综合考虑了实验教学和科学研究的特点，将两者紧密结合起来，可以增进实验教学与科学研究的联系。通过本实验，不仅可以使学生掌握多肽序列的合成方法，加深对基础实验原理和实验操作的理解，还可以培养学生在较高层次上了解多肽序列的特殊应用，有利于扩宽学生的知识面，培养学生的实践能力和创新能力。

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∙化学实验∙

Synthesis and Biological Research of Polycationic Oligopeptide: A Research-Based Experiment Recommended for Chemical Biology Majoring Students

SUN Yun-Xia*ZHANG Xian-Zheng
(Key Laboratory of Biomedical Polymers of Ministry of Education & Department of Chemistry, Wuhan University, Wuhan 430072, P. R. China)

Abstract:The oligopeptide R8was synthesized through the solid phase peptide synthesis (SPPS) protocols, and the molecular weight was measured by MS-ESI. The biological application of R8was investigated by agarose gel electrophoresis assay and endocytosis. Through this experiment, students can study and apply organic chemistry, polymer chemistry, and chemical biology, as well as develop their capability for analyzing and resolving problems.

Key Words:Amino acid; Oligopeptide; Peptide; Gel electrophoresis

中图分类号：O6-33；G64

doi:10.3866/PKU.DXHX20160342

*通讯作者，Email: yx-sun@whu.edu.cn

基金资助：国家自然科学基金项目(21004046，51473126)