王　谦，温　凯，沈建忠（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）



β-内酰胺类抗生素残留分析的新型荧光检测物

王谦，温凯，沈建忠
（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）

摘要：利用遗传编码非天然氨基酸技术（UaaTech）制备了带有荧光氨基酸（7-羟基香豆素-4-基）-乙基甘氨酸（7HC）的重组青霉素结合蛋白PBP2x-7HC。以该新型荧光检测物为基础建立的β-内酰胺类抗生素残留检测法对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、苯唑西林、双氯西林、头孢噻呋、头孢喹肟、头孢洛宁、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢匹林和头孢乙腈的最低检测限分别为0.49～2.44 ng/mL，均达到欧盟最低残留限量（MRL）标准，原奶中添加回收率为78%～102%，成品奶中添加回收率为76%～112%。该新型荧光检测物具有捕获分析物和产生检测信号的双重功能，简化了分析过程，实现了小分子物质的非竞争性免疫分析，是兽药残留检测方法的有益扩充。

关键词：β-内酰胺类抗生素；残留分析；非天然氨基酸；荧光

1　材料与方法

1.1试剂与材料限制性内切酶和DNA聚合酶，购自NEB公司；引物合成和测序在Invitrogen公司进行，pET40b载体和UaaTech工具分子质粒pE⁃VOL-7HCRS由美国SALK研究所Lei教授馈赠，分子克隆试剂盒及BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，购自天根生化科技（北京）有限公司；大鼠抗

His抗体本实验室自制，β-内酰胺类抗生素标准品，购自Sigma Aldrich，其他常规化学试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2原核表达载体的构建利用引物P1和P2 （P1：gggCATAGTaagtggacaaaaa；P2：gggCTCGAGgtctcctaaagttaa），将目的基因片段（PBP2x，Met 1-Asp 750，Δ29-49aa）扩增并亚克隆到pET40b载体中，命名为pET40b-PBP2x。利用引物P3和P4（P3：CCACGATTCGAGATtagGACGTTAATG；P4：TAATCTCGAATCGTGGCATCTGCAAT）以及全式金Fast Mutagenesis System试剂盒对pET40b-PBP2x进行点突变，将PBP2x的第374位色氨酸Trp的密码子由TGG突变为琥珀酰终止密码子TAG，经过测序验证，命名为pET40b-PBP2x_W374TAG。……