孙寒静，刘志和，吴艳华，喻腾云

川芎嗪对急性脑梗死大鼠CD40/CD40L信号通路的影响及机制探讨

孙寒静，刘志和，吴艳华，喻腾云

广州市红十字会医院/暨南大学医学院附属广州红十字会医院(广州 510000)，E-mail：zhangjie567@hotmail.com

摘要：目的研究不同剂量川芎嗪对急性脑梗死SD大鼠血清及脑组织中CD40、CD40L含量的影响。探讨川芎嗪治疗急性脑梗死过程中CD40/CD40L信号通路干扰的作用机制。方法采用改良Zea Longa法制作急性脑梗死模型大鼠，检测不同剂量川芎嗪治疗前后大鼠神经功能变化，外周血sCD40L水平及CD40、CD40L在脑组织中的表达。结果治疗后大鼠神经功能改善明显优于模型组(P<0.05)，其中高、中剂量治疗组神经功能改善明显优于低剂量组(P<0.05)；治疗组外周血中SCD40L水平和脑组织中CD40、CD40L的表达较模型组均明显降低(P<0.01)；高、中剂量治疗组血清SCD40L水平和脑组织中CD40、CD40L的表达低于低剂量组(P<0.05)，高、中剂量组之间相比无统计学意义(P>0.05)。结论川芎嗪能有效改善神经功能损伤，其治疗效用可能与CD40/CD40L信号通路下调其介导的炎症凋亡分子生物学因素有关。

关键词：急性脑梗死；川芎嗪；CD40/CD40L；信号通路干扰；作用机制；神经损伤；大鼠

急性脑梗死(ACI)是临床常见的神经系统疾病，属于中医“中风”范畴，作为“风、痨、臌、膈”古代四大疑难病证之首，具有发病率高、致死率高、致残率高、复发率高及治疗费用高等临床特点。据统计2010年我国死于脑卒中的病人近170万，缺血性脑梗死占脑血管意外事件的80%[1]。脑动脉粥样硬化是急性脑梗死最重要的病理学基础，在病变过程中，斑块的形态特征及稳定性与脑梗死的发生关系密切。有研究表明[2]，CD40/CD40L信号通路可刺激斑块内单核巨噬细胞分泌MMP(尤其是MMP-8和MMP-9，通过降解基质成分，使斑块承受血流剪切力和机械压力的能力下降，最终导致斑块破裂。本研究以急性脑梗死模型SD大鼠为研究对象，研究不同浓度川芎嗪对模型大鼠血清及脑组织中CD40及CD40L浓度的变化，探讨CD40/CD40L信号传导通路对急性脑梗死的损伤作用机制及最佳治疗剂量，为临床提供理论依据及指导用药。

1材料与方法

1.1动物分组SD大鼠60只，雄雌各半，体重250 g～300 g，由广东省中医院实验动物中心提供，许可证号：SYXK9(粤)2008-0094。随机分为阳性对照组、模型对照组、川芎嗪高剂量组、川芎嗪中剂量对照组、川芎嗪低剂量对照组及空白对照组(单纯手术不加线)，每组10只，雄雌各半。

1.2主要药物及试剂川芎嗪注射液(规格：40 mg/2 mL，国药批号：H20054485，上海现代哈森药业有限公司)；阿司匹林肠溶片(规格：100 mg/片，拜耳医药保健公司)；尼莫地平片(规格：20 mg/片，山东新华制药股份有限公司)；10%水合氯醛(由本院实验室提供)；生理盐水(由本院实验室提供)；枸橼酸钠注射液；Elisa试剂盒(美国R&DSystem公司提供，购自晶美生物工程有限公司)；浓缩型兔抗人CD40及CD40L单克隆抗体(一抗)、酶标抗鼠/兔聚合物(二抗，购自Abcam公司)；即用型免疫组化EliVisionTM plus试剂盒、DAB显色试剂盒及磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS；购自福州迈新生物技术有限公司)。sCD40L的浓度单位为ng/mL，灵敏度0.156。

1.3主要仪器渔线(日本钓鱼人株式会社有限公司)、低速控温离心机、医用低温电冰箱、水浴箱、酶标仪、切片机(德国ZEISS公司)、光学显微镜(日本)。

1.4模型制备参照改良的Zea Longa法制备一侧大脑中动脉阻塞(MCAO)动物模型[3]。术前准备及手术步骤：术前禁食不禁水12 h，随后称重计数。大鼠以10%水合氯醛腹腔注射(30 mg/100 g)后，固定于操作台上，常规消毒后，沿颈部正中线切开，分离皮下组织，分离出右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉远心端和近心端，并在两节间把血管剪断，夹闭颈总动脉和颈内动脉，从颈外动脉的游离端剪一小切口，将渔线插进颈内动脉(18.5±0.5)mm，缝合伤口，缺血2 h后再灌。造模大鼠清醒后，按照Zea Longa进行神经功能评分[3]，0分：无神经病学征象；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直；2分：向瘫进行痪侧旋转征象；3分：向病灶对侧跌倒；4分：无自发活动及意识障碍者。神经功能评分为1分～3为实验所需，其余弃之不用。

1.5剂量设计依据盐酸川芎嗪注射液在治疗急性脑梗死时，临床使用剂量为120 mg，换算成大鼠给药剂量为10.8 mg/kg(按成人体重为70 kg折算，并拟定为10 mg/kg计量，利于实验注射取量)。分别按大鼠1倍、2倍、4倍临床等效剂量为实验使用剂量，即依次按川芎嗪注射液10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg拟定给药，分别为川芎嗪低、中、高剂量组。

1.6药物制备及给药方法用蒸馏水配成含阿司匹林2.2 mg/mL，含尼莫地平0.875 mg/L的混悬液，置于4℃冰箱备用。 除模型对照组和空白对照组予以生理盐水0.5 mL腹腔注射外，治疗组中的高、中、低剂量组及阳性对照组，在缺血后2 h统一予阿司匹林尼莫地平混悬液10 mL/kg灌胃，并按低、中、高及阳性对照组，分别予川芎嗪注射液按10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、生理盐水0.5 mL腹腔注射，每日一次，连用3 d。给药组均按人鼠体表换算。

1.7取材动物脱臼处死，取出大脑，冰冻的PBS清洗组织表面血液，取缺血侧大脑的颞叶组织，石蜡切片常规脱蜡至水，所有蜡块均连续切片为4 μm，每个蜡块切两张，进行HE染色及免疫组织化学检测。取大鼠股动脉血，抗凝管收集之后2 000 r/min离心15 min，用移液器吸取中间黄衣层放置于EP管内，放入-20 ℃冰箱中冻存备用。

1.8观察指标及方法待动物苏醒后对大鼠进行神经功能缺损评分，并记录实验数据。

1.8.1大鼠血清中sCD40L测定采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定(Elisa)，所有标本收集后由专业人员测定(严格按照说明书)。

1.8.2大鼠脑组织病理学观察将已制备好的石蜡切片，进行HE染色，在光镜下进行观察。

1.8.3炎性因子CD40、CD40L在脑组织中的表达采用免疫组化法。将已制备好的石蜡切片，微波修复抗原，3%H2O2液室温孵育10 min以阻断内源性过氧化氢酶活性，PBS冲洗，加入一抗(工作浓度为1：100)，4℃孵育过夜，PBS冲洗，加入聚合物增强剂，室温孵育20 min，PBS冲洗，加入二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗后，DAB显色，苏木精复染，0.1%盐酸分化，PBS返蓝，常规脱水透明，中性树脂封固。每批次均设阳性对照片(试剂公司提供的空白石蜡切片)1张，PBS液取代一抗作阴性对照。结果判定：以细胞质内出现棕黄色至深棕色颗粒为阳性细胞。阳性细胞必须符合以下标准：①细胞结构清晰；②阳性颗粒定位准确；③着色明显高于背景，对比清楚。①按显色细胞数记分，阳性细胞数<1/3为1分，阳性细胞数1/3～2/3为2分，阳性细胞数>2/3为3分。②按细胞显色深浅记分，无阳性反应细胞为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。积分数=A×B，A×B=0判断为(-)，A×B=1～2判断为(+)，A×B=3～4判断为(++)，A×B=6～9判断为(+++)。至少随机观察5～10个高倍镜视野(放大倍数为×400)。

2结果

2.1神经功能缺损评分(NSS)术后大鼠苏醒后，要求颈部伤口无渗血，无大鼠死亡。手术后，各组大鼠与空白对照组比较，各组大鼠均表现出不同程度的神经功能缺损，提尾时可见病灶对侧前肢不能完全伸直且紧贴于胸壁，部分大鼠行走时可见向瘫痪侧进行旋转征象，甚至跌倒不起。除空白对照组外，各组神经功能评分多在(1～3)分。

治疗前，空白对照组与各组神经功能障碍评分比较具有统计学意义(P<0.01)，动物造模成功；除空白对照组外，各组间评分对比无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。治疗后，模型组与空白对照组比较，模型组大鼠神经功能评分增加，除空白对照组，与模型组比较，各组评分均有所减少(P<0.05或P<0.01)。治疗后高、中剂量组的神经损伤评分低于模型组(P<0.01)。详见表1。

表1　各组大鼠神经功能缺损评分比较(±s)分

2.2大鼠血清中sCD40L的表达空白对照组与其他各组相比，sCD40L表达最弱，且差异有统计学意义(P<0.01)；除空白对照组外，阳性对照组与川芎嗪低剂量组比较，血清中sCD40L表达无统计学意义，与余下各组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；川芎嗪低剂量组分别与川芎嗪高剂量组、川芎嗪中剂量组比较，sCD40L表达偏高(P<0.05)；川芎嗪高剂量组与川芎嗪中剂量组比较，sCD40L在血清中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2　SD大鼠血清中sCD40L表达比较(±s)

2.3脑组织病理学观察空白对照组脑组织无缺血性表现，组织形态正常，细胞排列、结构形态规整，基本没有细胞的病变及坏死现象。模型组缺血区细胞数量减少，细胞排列松散，细胞间隙增宽，神经元胞浆及胞膜形态不规则、边界不清，呈缺血样病理改变，可见细胞核明显的固缩，空泡样变性坏死数量较多。阳性对照组可见细胞排列紊乱，神经元较少，细胞核有固缩和空泡现象，细胞间隙部分增宽，与低剂量组形态学改变相当。空白对照、低剂量两组与模型组对比，神经元细胞稍有增多，固缩和空泡样变稍减少，细胞间隙改善不明显。中、高剂量两组与模型组对比，神经细胞排列层次稍欠整齐，固缩、空泡样变和细胞间隙明显改善，与低剂量组对比可见神经细胞坏死数量明显减少。高剂量组总体跟中剂量组相差不大，小部分出现坏死神经细胞没有中剂量组的效果明显。

2.4川芎嗪对SD大鼠脑组织CD40、CD40L表达的影响模型组与空白对照组比较，大鼠脑组织CD40、CD40L含量均增加，具有统计学意义(P<0.01)；与低剂量组比较，高、中剂量组CD40、CD40L含量减少幅度较大，具有统计学意义(P<0.05)；高剂量组与中剂量比较，高剂量大鼠脑组织CD40、CD40L略高于中剂量组，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3　各组大鼠脑组织中CD40、CD40L的表达比较(±s)

3讨论

CD40/CD40L是一对互补跨膜糖蛋白，分别属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)及肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，作为炎性和免疫反应中的重要信号传导通路，参与调控免疫、炎症、高凝等多种病理状态，可激活炎症反应、活化血小板，导致内皮功能障碍等[4]。由于CD40蛋白分子结构本身在信号传导过程中表达的活性较低，只有与CD40L结合活化后，使得CD40化学结构发生了转变，活性增强，可促进单核细胞的黏附、特定的转录因子激活、趋化因子的分泌等。而转录因子的活化、单核细胞的黏附及趋化因子都可造成炎症反应，对脑组织造成损伤，反过来这些炎性介质也可上调CD40及CD40L的表达，加重脑缺血损伤。近年来有研究发现，缺血性脑血管病上调了CD40/CD40L系统表达，引起炎性因子释放增多，最终引起动脉硬化斑块不稳定，进而破裂、脱落，促使脑梗死的形成[5]。另一方面，脑组织缺血缺氧后，梗死灶的脑组织产生大量的炎性介质，释放细胞毒性物质和自由基，诱导中性粒细胞和内皮细胞的黏附，介导缺血瀑布反应[6]。川芎嗪作为临床经验用药，能透过血脑屏障，具有扩张脑血管、增加血流量、降低耗氧量、改善微循环、抑制血小板聚集等作用[7]。

本研究运用川芎嗪结合急性脑梗死发病过程中病理机制，从多角度、多层次、多靶点研究治疗急性脑梗死时所具有抗炎症作用。模型组比空白对照组的CD40、CD40L表达明显增多，川芎嗪各治疗组比阳性对照组的CD40、CD40L表达明显减少，且差异都有统计学意义。证实川芎嗪可通过抑制CD40/CD40L炎症信号通路传导，抑制一系列炎症反应，起到了保护脑组织的作用。川芎嗪对急性脑梗死病人的CRP水平变化研究发现，川芎嗪能有效降低C反应蛋白(CRP)含量[8]。CRP作为炎性因子，能够激活并下调CD40/CD40L信号传导通路。本实验也证明了川芎嗪对急性脑缺血模型大鼠脑组织具有保护作用。

川芎嗪能降低脑梗死急性期的神经缺损评分，改善神经损伤症状，提高生存质量及治疗功效。可能与其抑制缺血局部炎症反应、减少炎症因子的释放有关。

参考文献：

[1]Yang G，Wang Y，Zeng Y，et al.Rapid health transition in China，1990-2010：findings from the global burden of disease study 2010[J].Lancet，2013，381(9882)：1987.

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(本文编辑王雅洁)

基金项目：广东省中医药管理局建设中医药强省科研基金资助项目(No.20121003)；广州市卫生局资助项目(No.2013A011037)

中图分类号：R743.3R289.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.010

文章编号：1672-1349(2016)10-1087-04

(收稿日期：2016-02-24)