蔡学杰，高玉琪，李晓燕，陈英剑，梁　春，吴宗贵



丹参多酚酸盐对ApoE-/-小鼠主动脉壁细胞清道夫受体A和CD36 mRNA表达的影响

蔡学杰，高玉琪＊，李晓燕，陈英剑，梁春，吴宗贵

[摘要]目的观察中药丹参多酚酸盐对ApoE基因敲除小鼠主动脉壁血管细胞清道夫受体A和CD36 mRNA表达的影响，探讨丹参多酚酸盐抗动脉粥样硬化进展的作用机制。方法30只AopE基因敲除小鼠（4周龄，雄性）随机分成4组，即模型组（腹腔注射生理盐水，7只）、丹参多酚酸盐60mg/kg组（7只）、丹参多酚酸盐120mg/ kg组（8只）、丹参多酚酸盐240mg/kg组（8只），正常对照组（C57BL/6J野生型小鼠）6只。高脂饮食喂养于24周末时处死各组动物，取主动脉根部连续切片，常规苏木精-伊红染色，观察血管壁形态和脂质沉积情况，采用逆转录聚合酶链式反应对主动脉血管壁细胞清道夫受体A和CD36 mRNA表达进行定性和定量分析。结果ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化斑块内均可见明显的SR-A和CD36mRNA表达，C57BL/6J小鼠正常血管内仅见少量表达；丹参多酚酸盐（240mg/kg组）干预后，与模型组比较，ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化斑块内CD36 mRNA表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），而SR-A mRNA的表达未见明显减少（P＞0.05）。结论中药丹参多酚酸盐抗ApoE-/-鼠主动脉粥样硬化可能与其下调CD36mRNA表达，减少巨噬细胞泡沫细胞的形成有关，而与SR-A无关。

[关键词]丹参多酚酸盐；ApoE基因敲除小鼠；清道夫受体；动脉粥样硬化

清道夫受体（scarvenger，SR）是一类结构多样化的糖蛋白受体家族，主要分布在巨噬细胞膜上。目前研究发现，清道夫受体与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）、细胞黏附、细胞增殖和细胞凋亡等密切相关[1]，其中，清道夫受体A（SR-A）和清道夫受体B类中的CD36是吞噬氧化修饰的低密度脂蛋白，形成泡沫细胞的主要受体[2]。由于动脉粥样硬化斑块内存在大量激活的巨噬细胞，巨噬细胞吞噬氧化性脂蛋白转变为泡沫细胞是AS斑块形成的特征性改变和始动环节，因此将SR-A和CD36作为AS斑块作用靶点的研究，目前成为一热点。丹参多酚酸盐（salvianolate，sal）是从传统中药丹参中采用现代科学工艺技术提取的水溶性有效成分，具有活血化瘀、抗氧化和抗氧自由基的作用[3]，与AS的关系密切。本研究用RT-PCR方法观察丹参多酚酸盐对C57BL/6J ApoE基因敲除小鼠AS斑块内SR-A和CD36 mRNA表达的影响，来深入探讨丹参多酚酸盐抗AS进展的作用机制，为丹参多酚酸盐抗AS提供理论和实践依据。

1　材料与方法

1.1动物与分组、主动脉AS模型的建立及给药方法雄性4周龄C57BL/6J AopE基因敲除小鼠32只，普通饲料适应性喂养1周后给予高脂饮食（含2％胆固醇和5％的猪油，其余为普通饲料），继续喂养4周，随机处死2只，取主动脉根部，HE染色普通光镜下观察，确定已形成动脉粥样硬化斑块后，将其余30只ApoE基因敲除小鼠随机分成4组，即模型组（仅腹腔注射生理盐水，7只）、丹参多酚酸盐60mg/kg组（7只）、丹参多酚酸盐120mg/kg组（8只）、丹参多酚酸盐240mg/kg组（8只），正常对照组（即C57BL/6J野生型小鼠6只）。应用上海绿谷制药有限公司生产的中药注射粉针剂：注射用丹参多酚酸盐100mg，溶于0.9％的氯化钠溶液10 ml中，按以上分组剂量给予丹参多酚酸盐腹腔注射，每周5次，继续喂养至24周。24周末时模型组、丹参多酚酸盐60mg/kg组、丹参多酚酸盐120mg/kg组、丹参多酚酸盐240mg/kg组和正常对照组分别死亡1只、1只、2只、2只、1只。实验动物均由北京大学实验动物中心提供。

1.2动物处死和主动脉标本采集于实验24周末取血后处死动物，取出主动脉，切取主动脉根部1cm；其余血管标本立即置于液氮中保存；部分标本于4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定后，常规石蜡包埋，做病理切片用。

1.3RT-PCR法检测各组SR-A和CD36mRNA表达[4]称取主动脉血管组织50mg，至玻璃匀浆器，加入TRIzol（Gibco BRL提取总mRNA试剂盒）1 ml，充分混匀并静置后，吸出上清液置于EP离心管内，按试剂盒说明书提取总mRNA，并逆转录（Gibco BRL逆转录试剂盒）。分别取2μl cDNARNA为模板，各加入SR-A和CD36引物（终浓度均为1μmmol/L）进行PCR（总体积均为30μl）。SR-A和CD36引物序列和产物长度分别为：SR-A：上游5'-TAGGCACTT GGGATGTCTGA-3，下游5'-GTCCTCA ATTTGTATT GGT GCT -3'，854 bp；CD36：上游5'-TGCTGGAGCTGTTATTGGTG-3'，下游5'-AC AAACCTCCGTAAGAGTAC-3′，343 bp。PCR条件为：30℃变性10min，50℃退火30min，99℃延伸5min，共40个循环后50℃延伸5min。同时分别取2μl cDNA-RNA为模板，加入β-actin引物（终浓度均为1μmmol/L）：上游5'-AACAGT CCGCCTA GAAG CAC-3'，下游5'-CGT TGACAT CCG TAA AGACC -3'，281 bp。PCR条件为：95℃变性5min，95℃退火10min，57℃延伸20 s，共40个循环后84℃延伸5min。扩增后行1.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据扩增产物分子量确定其是否为欲扩增的片段。利用凝胶成像系统进行拍照，用图像分析仪以Quantity one软件进行分析，测定电泳带的平均吸光度值，计算SR-A、CD36分别与β-actin电泳带的平均吸光度比值，分别表示SR-A和CD36mRNA水平。

1.4统计学处理及方法应用SPSS11.0统计软件包进行统计学处理。实验数据以（x±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用完全随机设计的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1主动脉AS模型的病理改变C57BL/6J野生型小鼠饲养过程中死亡1只，喂食高脂饮食后，血管内膜光滑，未见动脉粥样硬化斑块形成；ApoE基因敲除鼠饲养过程中共死亡6只，高脂饲养12周后，均出现明显的动脉粥样硬化，粥样斑块内可见大量泡沫细胞及胆固醇结晶，内膜增厚，斑块体积大。C57BL/6J野生型小鼠血管壁内，血管内膜光滑，无动脉粥样硬化斑块。丹参多酚酸盐240mg/kg组干预后动脉粥样斑块较小，AS减轻。如图1。

图1　主动脉AS模型的病理改变（HE×100）

2.2丹参多酚酸盐对各组SR-A mRNA和CD36m RNA表达的影响ApoE基因敲除小鼠AS斑块内可见明显的854 bp和343 bp片断，为SR-A和CD36mRNA表达，C57BL/6J小鼠正常血管内仅见少量表达，说明AS斑块血管能大量表达SR-A mRNA 和CD36mRNA，而正常血管壁表达SR-A mRNA和CD36mRNA量较少。丹参多酚酸盐（60mg/kg组）和丹参多酚酸盐（120mg/kg组），ApoE基因敲除鼠AS斑块内CD36 mRNA表达与对照组比较，无明显变化；丹参多酚酸盐（240mg/kg组）处理后，ApoE基因敲除鼠AS斑块内CD36 mRNA表达明显减少，而丹参多酚酸盐各组SR-A mRNA表达与对照组比较未见明显减少，说明丹参多酚酸盐能够下调AS斑块内CD36mRNA表达，而不影响SR-A mRNA的表达。见图2、3和表1、2。

图2　丹参多酚酸盐对各组巨噬细胞SR-A mRNA的作用

图3　丹参多酚酸盐对各组巨噬细胞CD36 mRNA的作用

表1　丹参多酚酸盐对ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块SR-A mRNA/β-actin mRNA比较（x±s）

表2　丹参多酚酸盐对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块CD36 mRNA/β-actin mRNA比值比较（x±s）

3　讨论

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一个复杂的病理过程，是多种因素共同作用的结果。通过清道夫受体吞噬变性低密度脂蛋白，形成泡沫细胞以及堆积造成血管壁上的脂质纹理，是AS形成早期的重要特征。其中SR-A和CD36是吞噬变性ox-LDL，形成泡沫细胞的主要受体。SR-A是巨噬细胞上识别ox-LDL，ac-LDL的特异性受体，Tsukamoto等发现SR-A在动脉粥样硬化斑块中高度表达，并且其配体ox-LDL也存在于斑块中[5]，修饰的LDL 于SR-A结合导致巨噬细胞中脂质的堆积，并且SR-A对LDL的摄取是无限制的，最终导致泡沫细胞形成，甚至斑块破裂，而SR-A活性降低可减弱这一过程。CD36在体内的配基相当广泛，参与多种生理过程，它是巨噬细胞表面主要的识别、内吞氧化ox-LDL的SR，参与了动脉粥样硬化形成。Nakata等[6]通过尸检发现的胸主动脉AS斑块，脂质条纹，泡沫细胞都有CD36表达；免疫组化显示CD36和SR-A在AS斑块的不同部位表达不同，CD36阳性巨噬细胞-泡沫细胞主要分布在粥样硬化斑块核，而SR-A主要分布在斑块核外围，这种表达分布的不同，特别是富含脂质的巨噬细胞与CD36阳性巨噬细胞分布的一致提示了CD36在摄取ox-LDL，巨噬细胞转化为泡沫细胞中发挥重要作用。实验发现，在动脉血管损伤处有SR-A的表达，并随着斑块的进展SR-A表达量逐渐增多。Nakagawatoyama等于1995年报道用对比分析法分析人AS病变上CD36与SR-A的表达，结果显示SR-A表达在动脉管腔附近，而CD36则在粥样斑块的巨噬细胞源性泡沫细胞附近有高表达。进一步研究发现，与SR-A不同，CD36识别的是OX-LDL中磷脂，而SR-A识别的是OX-LDL中的载脂蛋白部分[7，8]。

ApoE基因敲除鼠动物模型发现CD36及ApoE基因双敲除小鼠，高脂餐喂养12周动脉损伤较ApoE基因敲除小鼠减少70％以上[9]，继续观察20 及35周后，这种保护作用仍然存在[10]。进一步在此模型基础上，采用致死量放疗和干细胞移植的方法，观察到只缺乏巨噬细胞CD36表达可以明显减少AS的形成，主动脉树斑块面积减少88. 1％，由此可见巨噬细胞CD36缺失起到更主要的作用[11]。CD36的特异性配体EP80317可以减轻ApoE基因敲除小鼠AS损伤的形成[12]。上述均提示CD36在促进AS形成中的作用。

本研究发现ApoE基因敲除鼠AS斑块内可见泡沫细胞聚集，呈圆形或椭圆形。ApoE基因敲除小鼠AS斑块内可见明显的854 bp和343 bp片断，为SR-A和CD36 mRNA表达，C57BL/6J小鼠正常血管内仅见少量表达，说明AS斑块血管能大量表达SR-A mRNA和CD36 mRNA，而正常血管壁表达SR-A mRNA和CD36 mRNA量较少。丹参多酚酸盐（240mg/kg组）处理后，ApoE基因敲除鼠AS斑块内CD36 mRNA表达明显减少，而SR-A mRNA表达未见明显减少，说明丹参多酚酸盐能够下调AS斑块内CD36 mRNA表达，而不影响SR-A mRNA的表达，提示丹参多酚酸盐可能主要通过下调AS斑块内巨噬细胞吞噬ox-LDL的主要受体CD36 mRNA的表达，来减少核心部分的脂质堆积，尤其是胆固醇的沉积，减少泡沫细胞形成，而斑块破裂与其所含的胆固醇量有关，从而起到稳定斑块的作用，阻止动脉粥样硬化的进一步发展，此可能是丹参多酚酸盐在分子水平抗AS的作用机制之一。

丹参多酚酸盐下调CD36表达的调控机制如何，目前尚不清楚，有报道ox-LDL被CD36识别，内吞入巨噬细胞后，部分酯链被切割产生9-HODE （hydroxyoctadecadienoic acid 9），13 -HODE（hy -droxyoc-tadecadienoic acid 13）等产物，它们作为过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）的配基激活PPARγ，进而使CD36的转录合成增加，增加的CD36则识别摄入更多ox-LDL，这就是CD36对ox-LDL摄取的正反馈机制假说[13]。体外实验发现ox-LDL的主要成分CHOOE、LDL过氧化的主要产物HNE，分别通过PPARα和Nrf2上调CD36的转录与表达[14]。笔者推测丹参多酚酸盐可能影响上述调控过程中的PPARγ和Nrf2，还需进一步研究证实。

参考文献

[1]Freeman M，Ekkel Y，Rohrer L，et al. Expression of type I and type II bovine scavenger receptors in Chinese hamster ovary cells：lipid droplet accumulation and nonreciprocal cross competition by acetylated and oxidized low density lipoprotein[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1991，88（11）：4931-4935.

[2]Stachowska E，Baskiewicz M，Marchlewicz M，et al. Conjugated linoleic acids regulate concentration triglycerides and cholesterol of macrophages/foam cells by modulating of CD36 expression [J]. Acta Biochim Pol，2010，57（3）：379-849.

[3]杜冠华，张均田.基础医学与临床.丹参水溶性有效成分：丹酚酸研究进展[J]. 2000，20（5）：394-398.

[4]Antonov AS，Kolodgie FD，Munn DH，et al. Regulation of macrophage foam cell formation by Vβ3 integrin[J]. Am J Pathol，2004，165（1）：247-258.

[5]Tsukamoto K，Kinoshita M，Kojima K，et al. Synergically increased expression of CD36，CLA-1 and CD68，but not of SR-A and LOX-1，with the progression to foam cells from macrophages[J]. J Atheroscler Thromb，2002，9（1）：57-64.

[6]Nakata A，Nakagawa Y，Nishida M，et al.CD36，a novel receptor for oxidized low-density lipoproteins，is highly expressed on lipid-laden macrophages in human atherosclerotic aorta[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19（5）：1333-1339.

[7]Nicholson A，Prieda S，Silverstein R. Oxidized LDL binds to CD36 on human monocyte-derived macrophages and transfectedcell lines. Evidence implicating the lipid moiety of the lipoprotein as the binding site[J]. Arterioscler Thromb，1995，15 （2）：269-275.

[8]Boullier A，Gillotte K，Horkko S，et al. The binding of oxidized low density lipoprotein to mouse CD36 is mediated in part by oxidized phospholipids that are associated with both the lipid and protein moieties of the lipoprotein[J]. J Biol Chem，2000，275（13）：9163-9169.

[9]Kunjathoor VV，Febbraio M，Podrez EA，et al. Scavenger receptors class A-I/II and CD36 are the principal receptors responsible for the uptake of modified low density lipoprotein leading to lipid loading in macrophages[J]. J Biol Chem，2002，277（51）：49982-49988.

[10]Guy E，Kuchibhotla S，Silverstein R，et al. Continued inhibition of atherosclerotic lesion development in long term Western diet fed CD36 degrees / apoE degrees mice[J]. Atherosclerosis，2007，192（1）：123-130.

[11]Febbraio M，Guy E，Silverstein RL. Stem cell transplantation reveals that absence of macrophage CD36 is protective against atherosclerosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（22）：2333-2338.

[12]Marleau S，Harb D，Bujold K，et al. EP 80317，a ligand of the CD36 scavenger receptor，protects apolipoprotein E-deficient mice from developing atherosclerotic lesions[J]. Faseb J，2005，19（13）：1869-1871.

[13]Jedidi I，CouturierM，Therond P，et al. Cholesteryl ester hydroperoxides increase macrophage CD36 gene expression via PPA Ralpha[J]. Biochem Biophys Res Commun，2006，351（3）：733-738.

[14]Ishii T，Itoh K，Ruiz E，et al. Role of Nrf2 in the regulation of CD36 and stress protein expression in murine macrophages：activation by oxidatively modified LDL and 4-hydroxynonenal [J]. Circ Res，2004，94（5）：609-616.

[2015-11-18收稿，2015-12-15修回]

[本文编辑：张鸿瑫]

药学

The effects of salvianolate on ApoE -knockout mice's aortic wall cell SR -A and CD36 mRNA expression

CAI Xue-jie①，GAO Yü-qi，LI Xiao-yan，et al.①Department of Cardiology，Chinese PLA No. 456 Hospical，Jinan，Shandong 250031，China

[Abstract]Objective To observe the effects of salvianolate on Apo E-knockout mice's aortic wall cell SR-A and CD36 mRNA expression，and to explore the mechanism of salvianolate's anti-atherosclerotic progress. Methods The 30 AopE knockout mice（4 weeks old，male）were randomly divided into 4 groups，namely，the model group（normal saline，7mice），salvianolate 60mg/kg group（7 mice），salvianolate 120mg/kg group（8 mice），salvianolate 240mg/kg group（8 mice），normal control group（C57BL/6J wild-type mice，6）. The each group of mice were killed after 24 weeks' high-fat diet. The aortic root serial sections were taken for routine hematoxy iineosin staining and observing vessel wall morphology and lipid deposition；reverse transcription polymerase chain reaction was used to analyse scavenger receptor A and CD36 mRNA expression on the aorta vascular wall cell in qualitative and quantitative analysis. Results The clear expression of SR-A and CD36mRNA in ApoE knockout mice atherosclerotic plaques were visible，in C57BL/6J mice with normal blood vessels only a small amount of expression was seen；After the intervention of Salvianolate（240mg/kg group），CD36 mRNA expression in ApoE knockout mice's atherosclerotic plaque was significantly reduced compared with model group. The difference was statistically significant（P＜0.05），while there was no significant decrease in the SR no-A mRNA expression（P＞0.05）. ConclusionThe anti -atherosclerosis function of salvianolate may be associated with decreasing CD36mRNA expression and reducing macrophage foam cell formation，but not with SR-A.

[Key words]Salvianolate；ApoE-knockout mice；Scarvenger receptor；Atherosclerosis

[中图分类号]R543.5

[文献标志码]A

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.05.020

[作者单位]250031山东济南，解放军456医院（蔡学杰）；济南军区总医院心内科（高玉琪，李晓燕），实验诊断科（陈英剑）；200003上海，第二军医大学长征医院心内科（梁春，吴宗贵）

[通讯作者]高玉琪，Email：why66390@126.com