陈志刚,王桂忠,吴荔生,贾启龙

(厦门大学 海洋与地球学院,近海海洋环境科学国家重点实验室,福建厦门361102)

3种海洋浮游微藻影响太平洋纺锤水蚤存活、发育和繁殖的比较研究

陈志刚,王桂忠*,吴荔生,贾启龙

(厦门大学 海洋与地球学院,近海海洋环境科学国家重点实验室,福建厦门361102)

摘要：采用实验生态的方法,研究了3种海洋浮游微藻对太平洋纺锤水蚤(Acartia pacifica)存活、发育和繁殖的影响．实验以不同浓度的微藻投喂太平洋纺锤水蚤,测定了无节幼体发育到桡足幼体、桡足幼体发育到成体的时间和最终存活率,以及发育到成体后,在各浓度下,成体每天的产卵量和卵孵化率．结果表明:球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)适宜于作为太平洋纺锤水蚤生长、繁殖的饵料;摄食牟氏角毛藻(Chaetoceros mulleri)的太平洋纺锤水蚤可以完成无节幼体到成体的发育,但牟氏角毛藻对太平洋纺锤水蚤的生长、发育和繁殖具有一定的负面影响;牟氏角毛藻对太平洋纺锤水蚤产卵量和卵孵化的抑制作用更为显著,只有在低细胞碳质量浓度(0.35 μg/mL)时,成体产卵量和卵的孵化才正常,当牟氏角毛藻细胞碳质量浓度达到1.70 μg/mL或更高时,该桡足类的产卵量下降,且没有卵能孵化出幼体,表明牟氏角毛藻显著抑制了太平洋纺锤水蚤的繁殖过程．

关键词：微藻;太平洋纺锤水蚤;存活;发育;繁殖

硅藻是草食性浮游动物(如桡足类)的主要食物,占全球初级生产量的25%[1].海洋桡足类是海洋生态系统中重要的次级消费者,浮游桡足类占海洋浮游动物生物量的80%,在食物网中,它是连接初级生产者与高营养级消费者的重要环节．桡足类作为鱼类的生物饵料,其生物量影响着鱼类的种群数量,因此近十几年来,对于硅藻与桡足类关系的研究逐渐成为关注的焦点．

有些研究认为硅藻对海洋桡足类的发育和繁殖有抑制作用．Ianora等[2]分别用甲藻类的微小原甲藻(Prorocentrumminimum)和硅藻类的圆海链藻(Thalassiosirarotula) 投喂柱形宽水蚤(Temorastylifera),发现在硅藻投喂组中桡足类卵的孵化被抑制;Turner等[3]、Dutz等[4]分别用单种硅藻,如圆海链藻、中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)、威氏海链藻(T.weissflogii)投喂桡足类一段时间后得到类似的结果．此外,Carotenuto等[5]、Ianora等[6]的实验结果表明投喂单种硅藻(圆海链藻、中肋骨条藻)的桡足类，其无节幼体发育率低且死亡率高．但也有研究结果认为硅藻对桡足类的发育和繁殖并无影响,如:Rebecca等[7]以硅藻投喂Tisbeholothuriae，其繁殖并未受到影响,无节幼体也可以正常发育到成体．Camus等[8]以硅藻类的牟氏角毛藻(Chaetocerosmulleri)和非硅藻类的球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、扁藻投喂尖额真猛水蚤(Euterpinaacutifrons),实验结果显示投喂牟氏角毛藻的该种猛水蚤从无节幼体发育到成体的时间最短、死亡率最低,认为牟氏角毛藻是该猛水蚤的良好饵料．

Halsband-Lenk等[9]在自然海域的研究结果支持硅藻抑制桡足类发育和繁殖的观点,海区中高浓度的海链藻使纽曼氏拟哲水蚤(Pseudocalanusnewman)的卵孵化率从90%降至43%．Vardi等[10]在硅藻爆发海区发现,桡足类卵孵化率、幼体存活率以及对硅藻摄食率都被抑制,大多数幼体呈不对称体型或出现畸形,在无节幼体第二期时就死亡．而Irigoien 等[11]在世界各大洋做了一系列现场调查,并没有发现硅藻与桡足类卵孵化率的相关性．Irigoien等[12]调查了海区中肋骨条藻对隆线拟哲水蚤(Calanoidescarinatus)和鼻锚哲水蚤 (Rhincalanusnasutus)产卵量与卵孵化率的影响,也得到了相似的结果．无论是室内实验还是现场调查的结果都表明硅藻对桡足类的影响具有物种特异性．Ianora等[13]的实验室研究结果显示,硅藻类的圆海链藻对不同桡足类繁殖的影响不同,对胸刺水蚤(Centropagestypicus)的影响最强烈,其次是柱形宽水蚤,对海哥兰哲水蚤(Calanushelgolandicus)和克劳氏纺锤水蚤(Acartiaclausi)的繁殖没有影响．Wichard等[14]的现场调查结果也证实了这一结论．

综上所述,硅藻与桡足类的相互关系目前仍然没有明确的结论．然而,有大量的研究表明:球等鞭金藻和微小原甲藻是海洋桡足类发育与繁殖的良好饵料．例如：摄食微小原甲藻的太平洋哲水蚤(C.pacificus)的卵孵化率高达96.6%[15];摄食微小原甲藻、球等鞭金藻的柱形宽水蚤的无节幼体可正常发育到成体,最终的存活率达到80%[5];用不同种的微藻投喂长角宽水蚤(T.longicornis),结果投喂球等鞭金藻的产卵率和卵孵化率最高[16]．

纺锤水蚤在我国南北沿岸海域均有分布,是我国海域优势的桡足类．不论是在自然海域还是在水产养殖中,都是经济海洋动物的良好饵料,其产量直接影响到水产养殖业和渔业的产量．然而硅藻对纺锤水蚤的生长、发育、繁殖的影响目前尚缺乏研究资料予以阐明.为了回答这个问题,本研究选择了硅藻类的牟氏角毛藻和非硅藻类的球等鞭金藻和海洋原甲藻(P.micans),以太平洋纺锤水蚤(A.pacifica)为投喂对象,通过比较研究这3种属于不同类群的海洋微藻对太平洋纺锤水蚤存活、发育和繁殖的影响，以期了解海洋桡足类的纺锤水蚤与硅藻之间确切的生态关系,为渔业生产和水产养殖可持续发展提供科技资料．

1材料和方法

1.1微藻培养

实验选用微藻中硅藻类的牟氏角毛藻和非硅藻类的球等鞭金藻和海洋原甲藻,藻种由厦门大学海洋微生物保种中心提供．用f/2培养液对这3种微藻进行培养,其中硅藻培养液加入适量的Na2SiO3．新接种的微藻先放在200 mL锥形瓶培养,培养到一定浓度后,转移至2 L锥形瓶,最后转移到5 L锥形瓶培养．微藻培养均在光照培养箱中进行,温度为(24±1) ℃,海水盐度为27±1,光照周期D∶L=12 h∶12 h,光照强度为2 000 lx．

1.2太平洋纺锤水蚤实验备用群体的培养

在厦门海域,用浅水Ⅱ型网平拖网采集太平洋纺锤水蚤．采集样品1 h内带到实验室,在解剖镜下分离挑取健康活泼的太平洋纺锤水蚤成体,放在2 L的结晶皿中以球等鞭金藻和海洋原甲藻为混合饵料进行多世代培养,培养的后代作为实验备用的群体,世代培养在光照培养箱中进行．实验备用群体世代培养的温、盐和光照条件与微藻培养的条件相同．

1.3太平洋纺锤水蚤生长、发育情况的测定

从实验备用群体中挑选300只太平洋纺锤水蚤的成体放在3 L的结晶皿中,投喂适量的球等鞭金藻和海洋原甲藻,等待其产卵．24 h后用孔径48 μm的筛绢收集卵,将卵移到50 mL装有过滤海水的结晶皿中,让其孵化．挑取3 h内孵化出的第一期无节幼体(NⅠ)100 只,放入相应浓度的培养液中进行世代培养,测定不同浓度的不同微藻影响其生长发育的情况．

太平洋纺锤水蚤世代培养的培养液分别由球等鞭金藻、海洋原甲藻和牟氏角毛藻的原液与0.45 μm滤膜过滤的海水配制而成．培养液的微藻浓度以藻类细胞碳质量浓度ρ(C)表示，设置5个梯度,分别为0.07，0.35，1.70，5.10，8.50 μg/mL,每个梯度设3个平行组．太平洋纺锤水蚤世代培养的容器为1 L的玻璃锥形瓶,每个锥形瓶注入500 mL配制好的、含有不同浓度不同微藻的培养液,放养100只NⅠ．世代培养期间每天更新60%(体积分数)培养液．世代培养的温、盐和光照条件与实验备用群体的世代培养条件相同．

当幼体发育到第六期无节幼体(NⅥ)时,每隔3 h观察并统计NⅥ的数量和存活率，根据半数NⅥ的发育时间确定整个无节幼体期的发育时间．采用SPSS 17.0软件对整个无节幼体发育期的发育时间和存活率进行概率回归统计[17]．用同样的方法计算和统计整个桡足幼体期的发育时间和存活率．将刚发育到成体的太平洋纺锤水蚤分离出来,用来做产卵实验．

1.4太平洋纺锤水蚤产卵量的测定

从上述用于太平洋纺锤水蚤生长发育测定的世代培养中，挑选刚发育到成体的雌雄成体用于产卵量测定．每种微藻各浓度设20个平行组(以确保最终能有15组的数据用于产卵量的统计分析),每组选取雌雄个体各1只(放入雄性个体的目的是为了保证雌性个体能够得到交配受精),养在30 mL的玻璃烧杯中,烧杯中装有相应微藻相应浓度的培养液．每天定期检查各烧杯中的产卵量,并将雌雄成体移到装有新培养液的新烧杯中继续培养(在确定所产的卵可孵化后,雄性成体则不再继续培养)．产卵量测定共进行12 d,在产卵量测定期间,成体培养的温、盐和光照条件与生长发育测定的世代培养条件相同．

英文大写字母相同代表不同藻类同一浓度下差异不显著(p>0.05),小写字母相同代表同种藻类不同浓度下差异不显著(p>0.05),下同．图1　不同微藻对太平洋纺锤水蚤无节幼体期(a)和桡足幼体期(b)发育时间的影响Fig.1The effects of different miacroalgae on developmental time of A． pacifica at the nauplius stage (a) and the copepodid stage (b)

1.5太平洋纺锤水蚤卵孵化率的测定

从上述产卵量测定实验的第3，6，9，12天产的卵中,每天取100粒(卵量不足100粒则取全部)放入装有100 mL膜滤海水的结晶皿中进行孵化实验,48 h后记录孵化出的幼体数量,计算每天卵的孵化率平均值．卵孵化的温度、盐度和光照条件与产卵量测定的培养条件相同．不同浓度不同微藻培养的太平洋纺锤水蚤其卵孵化率的测定均按此方法进行．

1.6统计分析

不同浓度不同微藻对太平洋纺锤水蚤生长发育、产卵量和卵孵化率的影响用单变量方差分析法分析,组间差异采用S-N-K法多重比较,统计软件采用SPSS 17.0．

2结果和分析

2.1微藻对太平洋纺锤水蚤幼体发育时间的影响

从图1(a)中可以看出:给太平洋纺锤水蚤无节幼体投喂3种不同微藻,随着藻浓度升高,发育时间缩短;投喂牟氏角毛藻,各浓度组无节幼体发育时间均比投喂球等鞭金藻和海洋原甲藻的长(p<0.05)．这些结果表明,与球等鞭金藻和海洋原甲藻相比,硅藻类的牟氏角毛藻更不适宜作为太平洋纺锤水蚤无节幼体的饵料．给太平洋纺锤水蚤无节幼体投喂低细胞碳质量浓度(0.07 μg/mL)的3种海洋微藻,所培养的无节幼体均不能发育到桡足幼体．图1(b)是投喂不同浓度不同微藻培养的太平洋纺锤水蚤桡足幼体期的发育时间,从中可以看出:随着球等鞭金藻和海洋原甲藻浓度的升高,太平洋纺锤水蚤桡足幼体的发育时间趋于稳定,而不同浓度的牟氏角毛藻对太平洋纺锤水蚤桡足幼体的发育时间无显著影响(p>0.05)．

2.2微藻对太平洋纺锤水蚤幼体存活率的影响

从图2(a)中可以看出:投喂高细胞碳质量浓度(8.50 μg/mL)的牟氏角毛藻抑制了太平洋纺锤水蚤无节幼体的存活率(p<0.05)．这个结果也表明,与球等鞭金藻和海洋原甲藻相比,硅藻类的牟氏角毛藻不适宜作为太平洋纺锤水蚤无节幼体的饵料．图2(b)是投喂不同浓度不同微藻培养的太平洋纺锤水蚤其桡足幼体期的存活率,从图中可以看出:随着球等鞭金藻浓度的升高,太平洋纺锤水蚤桡足幼体的存活率也在升高;不同浓度海洋原甲藻对太平洋纺锤水蚤桡足幼体存活率的影响不显著(p>0.05),各浓度组中桡足幼体的存活率都较高;随着牟氏角毛藻浓度的升高,太平洋纺锤水蚤桡足幼体的存活率下降.这些结果表明,与球等鞭金藻和海洋原甲藻相比,硅藻类的牟氏角毛藻在中、高浓度时对太平洋纺锤水蚤桡足幼体的存活有一定的负面影响．

图2　不同微藻对太平洋纺锤水蚤无节幼体期(a)和桡足幼体期(b)存活率的影响Fig.2The effects of different miacroalgae on survival rate of A． pacifica at the nauplius stage (a) and the copepodid stage (b)

2.3微藻对太平洋纺锤水蚤产卵量的影响

从图3中可以看出:给太平洋纺锤水蚤投喂球等鞭金藻,随着藻细胞碳质量浓度升高,太平洋纺锤水蚤产卵量也升高;投喂海洋原甲藻时,ρ(C)由0.35 μg/mL上升到1.70 μg/mL,雌性个体每日产卵量由25.1提高到45.8；随后开始下降,ρ(C)=8.50 μg/mL时,雌性个体每日产卵量仅为17.8;投喂牟氏角毛藻时,太平洋纺锤水蚤在ρ(C)=0.35 μg/mL下产卵量与投喂球等鞭金藻时无显著差异(p>0.05)；在较高浓度下,太平洋纺锤水蚤产卵量显著下降(p<0.05).这些结果表明，较高浓度的牟氏角毛藻对太平洋纺锤水蚤成体的产卵量有负面影响．

图3　不同浓度的不同微藻对太平洋纺锤水蚤产卵量的影响Fig.3The effects of different concentrations of microalgae on egg production of A． pacifica

2.4微藻对太平洋纺锤水蚤卵孵化率的影响

从图4中可以看出:给太平洋纺锤水蚤投喂球等鞭金藻,仅在ρ(C)=8.50 μg/mL时才对太平洋纺锤水蚤卵的孵化产生抑制作用,孵化率仅为29%;投喂海洋原甲藻时,ρ(C)由0.35 μg/mL上升到1.70 μg/mL,卵孵化率就受到抑制,由94%降至46%,随后稳定在此水平;投喂牟氏角毛藻培养的太平洋纺锤水蚤只有在ρ(C)=0.35 μg/mL时产的卵可以孵化,孵化率为66%,其他组所产的卵都不能孵化.这些结果表明,投喂高细胞碳质量浓度时的3种微藻所培养出来的太平洋纺锤水蚤，其卵的孵化率均会受到抑制,抑制程度因种类而异，海洋原甲藻的抑制程度大于球等鞭金藻,牟氏角毛藻的抑制程度最大．

图4　不同浓度不同微藻对太平洋纺锤水蚤卵的孵化率的影响Fig.4The effects of different concentrations of microalgae on hatching success of A． pacifica

3讨论

本文研究结果表明:球等鞭金藻、海洋原甲藻适宜于作为太平洋纺锤水蚤生长、繁殖的饵料;摄食牟氏角毛藻的太平洋纺锤水蚤可以完成无节幼体到成体的发育,但牟氏角毛藻对太平洋纺锤水蚤的存活和繁殖具有一定的负面影响;牟氏角毛藻对太平洋纺锤水蚤产卵量和卵孵化的抑制作用更为显著,只有在低细胞碳质量浓度(0.35 μg/mL)时,成体产卵量和卵的孵化才正常,当牟氏角毛藻细胞碳质量浓度达到1.70 μg/mL或更高时,该桡足类的产卵量下降,且没有卵能孵化出幼体,表明牟氏角毛藻显著抑制了太平洋纺锤水蚤的繁殖过程．已有研究表明,有些硅藻对海洋桡足类的生长、发育和繁殖有抑制作用,但硅藻类的牟氏角毛藻对太平洋纺锤水蚤繁殖过程产生负面影响的机制尚不清楚．作者正在用不同浓度的牟氏角毛藻投喂太平洋纺锤水蚤,进行多世代的培养,对各世代的成体进行蛋白质组学分析,以期阐明其影响的机制．

已有不少研究报道表明,高浓度的硅藻能产生有毒的胞外产物,对海洋桡足类的生长和存活具有抑制作用[6，16，19]．本研究中高浓度的牟氏角毛藻对太平洋纺锤水蚤的存活和繁殖的负面影响,是否由高浓度的牟氏角毛藻产生的有毒胞外产物所引起,尚待进一步研究．

在本研究中,不论是从太平洋纺锤水蚤无节幼体期和桡足幼体期的存活率和发育时间,还是从太平洋纺锤水蚤的产卵量及其卵的孵化率来看,投喂球等鞭金藻和海洋原甲藻的饵料效果均优于牟氏角毛藻,可以认为球等鞭金藻和海洋原甲藻是太平洋纺锤水蚤的良好饵料．已有不少研究报道认为,作为海洋桡足类的饵料,金藻的效果优于甲藻,甲藻的效果优于硅藻[5]．但在本文的图2(a)中,投喂细胞碳质量浓度为0.35 μg/mL的海洋原甲藻培养的太平洋纺锤水蚤其无节幼体存活率显著低于其他实验组,这可能是由以下原因导致的:1) 海洋原甲藻细胞颗粒大,不利于无节幼体对其摄食;2) 单个海洋原甲藻细胞体积约为球等鞭金藻细胞体积的200倍,在低浓度下,水体中海洋原甲藻的密度很低,无节幼体对其滤食的效率不高．

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A Comparative Study of the Effects of Three Marine Microalgae on Survival,Development and Reproduction of the Copepod Acartia pacifica

CHEN Zhigang,WANG Guizhong*,WU Lisheng,JIA Qilong

(State Key Laboratory of Marine Environmental Science,College of Ocean & Earth Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

Abstract:The effects of three marine microalgae (Isochrysis galbana,Prorocentrum micans,Chaetoceros mulleri) on survival,development and reproduction of Acartia pacifica was studied using an experimental ecology method． Microalgae at different cell concentrations were used to rear the larva of A． pacifica to adult,and then,the developmental time and survival rate from hatching to first stage of copepodid then to adult were determined．Egg production of each female and hatching success were also measured．The results suggested that I． galbana and P． micans were good diets to A． pacifica for growth and production,whereas C． mulleri showed negative effects on survival,development and reproduction of A． pacifica,though the diet C． mulleri could support the copepod to complete their development．Additionally,the egg production of females and hatching success were inhibited significantly when the copepods were reared with C． mulleri,but normal with low concentration (0.35 μg/mL) of the alga．When C． mulleri was fed to copepod at a concentration of 1.70 μg/mL or higher,the egg production of the copepod decreased with increasing concentration of the alga,and none egg could hatch,indicating that C． mulleri could inhibit the reproduction of A． pacifica significantly.

Key words:microalgae;Acartia pacifica;survival;development;reproduction

doi：10.6043/j.issn.0438-0479.2016.03.007

收稿日期：2015-06-17录用日期：2015-09-16

基金项目：国家自然科学基金(41276132)

*通信作者：gzwang@xmu.edu.cn

中图分类号:P 735

文献标志码：A

文章编号：0438-0479(2016)03-0343-06

引文格式：陈志刚,王桂忠,吴荔生，等.3种海洋浮游微藻影响太平洋纺锤水蚤存活、发育和繁殖的比较研究.厦门大学学报(自然科学版)，2016,55(3)：343-348.

Citation：CHEN Z G,WANG G Z,WU L S,et al．A comparative study of the effects of three marine microalgae on survival,development and reproduction of the copepodAcartiapacifica.Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(3)：343-348．(in Chinese)