王　锋　胡启立　李　健　赵　严　刘　华　汤茂春　夏小俊　孟宏波　宋振顺　徐晓蓉△

(1同济大学附属上海市第十人民医院消化内科, 2普外科　上海　200072)

Akt通过磷酸化p27诱导胆管癌细胞生长

王锋1胡启立2李健2赵严1刘华1汤茂春1夏小俊1孟宏波2宋振顺2徐晓蓉1△

(1同济大学附属上海市第十人民医院消化内科,2普外科上海200072)

【摘要】目的探讨Akt和p27蛋白控制胆管癌细胞生长的分子机制。方法利用突变载体、突变失活载体以及位点突变基因的转染技术,流式细胞仪检测PI3K、转染各类载体对胆管癌细胞周期的影响,免疫印迹、免疫荧光检测PI3K抑制剂、转染各类载体对P27蛋白表达及分布的影响。结果PI3K抑制剂LY294002引起胆管癌细胞株G1期细胞周期阻滞,并引起p27蛋白入核;Akt能通过诱导p27蛋白出细胞核而解除LY294002的G1期细胞周期阻滞;Akt通过磷酸化野生型p27蛋白第157位苏氨酸逆转细胞周期阻滞。 结论Akt通过磷酸化p27第157位苏氨酸来诱导p27细胞内重定位于细胞质,促进胆管癌细胞的生长。

【关键词】胆管癌;p27;Akt;磷酸化;细胞周期

胆管癌是源自胆管上皮细胞的恶性肿瘤,流行病学研究显示,胆管癌的发病率和死亡率在过去30 年间明显呈进行性增加趋势[1]。针对胆管癌发病机制,寻找靶基因进行靶向治疗是目前研究的热点。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)信号通路在肺癌、结肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞增殖、细胞周期、分化、凋亡过程中发挥重要作用,提示肿瘤的不良预后[2-3]。

p27作为细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂,能与cyclinE/CDK2和cyclinD/CDK4复合物紧密结合,同时其也是一种肿瘤抑制基因。研究发现包括胆管癌在内的几乎所有人类恶性肿瘤中,均存在p27蛋白的表达下调或缺失,是公认的抑癌蛋白。p27抑制cyclinE/CDK2从而引起细胞周期阻滞在G1期,且p27只有在细胞核中才能抑制细胞的生长。PKB又称Akt,能抑制p27的活性,PI3K信号通路可激活Akt发生磷酸化,Akt的激活也是胆管癌增长所需要的,然而,p27和Akt控制胆管癌细胞生长的分子机制目前尚不清楚。我们认为胆管癌细胞中Akt诱导p27功能的丧失,是依赖于p27磷酸化以及p27重新定位于细胞核之外所引起。

因此,本研究拟通过观察PI3K/Akt通路抑制剂对胆管癌细胞周期的影响,以及p27蛋白质水平及定位的变化,利用突变载体、突变失活载体以及位点突变基因的转染技术,以初步阐明Akt通过调控p27进而对胆管癌细胞生长产生影响。

材 料 和 方 法

材料和试剂人肝胆管癌细胞HCCC-9810细胞株来自中国科学院上海生物所细胞库,RPMI-1640 培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司。PI3K抑制剂LY294002、MEK信号通路抑制剂U0126、p27 Kip1抗体、α-tubulin抗体、RCC1抗体购自美国Cell Signaling公司,二抗购自美国Santa Cruz公司。第157位苏氨酸被替换为丙氨酸的p27蛋白(p27-T157A-GFP)、标记GFP的p27蛋白由美国罗切斯特大学Hong W.Yao教授惠赠。突变激活Akt载体(mutationally activated Akt,Myr-Akt)、显性失活突变Akt(dominate negative Akt,dn-Akt)购自美国Addgene公司。细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

Western blot法检测常规利用试剂盒分别提取细胞核蛋白和细胞质蛋白或提取细胞总蛋白。利用BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品,以10%SDS-PAGE凝胶电泳后,转移至PVDF膜,脱脂牛奶室温封闭2 h,加入一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜,加入二抗(1∶3 000)孵育1 h,洗膜后,以化学发光液显像,暗室中进行X光片压片、显影、定影后得到目的蛋白表达变化条带。取重复3次实验后的平均值作为实验结果。

免疫荧光染色不同处理的细胞爬片后,经4%甲醛固定10 min,0.5%Triton X-100破膜20 min,PBS清洗,一抗4 ℃ 孵育过夜,PBS清洗,37 ℃孵育荧光二抗1 h,DAPI染核,以含抗荧光淬灭剂的封片液封片。免疫荧光经共聚焦显微镜观察。

细胞周期采用流式细胞术检测细胞周期。对于各组不同处理的细胞,用胰蛋白酶消化并制备细胞悬液,加入75%的冰乙醇4 ℃固定过夜,再用PBS洗2次,加入终浓度为50 mg/L的核糖核酸酶A(RNase A),37 ℃孵育30 min,加入终浓度为50 mg/L的PI,4 ℃ 闭光染色10 min后用流式细胞仪检测。用Cell Quest获取、Mod Fit软件分析各组细胞的周期分布。

数据统计分析组间数据比较使用Student′st检验进行分析,所有数据均使用SPSS 11.0软件进行处理。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

LY294002对细胞周期及p27的影响与DMSO处理的对照组相比较,HCCC-9810细胞经PI3K抑制剂LY294002(50 μmol/L)处理后,导致G1期细胞数目增加(P=0.008 9),而MEK抑制剂U0126(20 μmol/L)并不能诱导G1期的细胞数目发生变化(图1A)。同时,PI3K抑制剂LY294002能增加HCCC-9810细胞中p27蛋白的总含量,而MEK抑制剂U0126对其并不产生影响(图1B)。

LY294002可诱导p27蛋白进入细胞核为评估p27蛋白在细胞内的具体分布情况及明确其发挥作用的机制,我们进一步检测了PI3K抑制剂和MEK信号通路抑制剂对p27在细胞质和细胞核分布情况的影响,结果显示,PI3K抑制剂LY294002能增加p27在HCCC-9810细胞核中的表达,并且降低其在细胞质中的表达(图1C)。而MEK信号通路抑制剂U0126对p27蛋白在细胞质和细胞核的分布情况并无影响。RCC1和α-tubulin的Western blot实验结果代表细胞核和细胞质成分的纯度。

A:Inhibitor of PI3K induces G1 arrest in HCCC-9810 cells.The percentage of cells in G1 phase was increased by the PI3K inhibitor,LY294002,compared with the DMSO control.MEK inhibitor,U0126,did not alter the number of cells in G1 phase.B:LY294002,increased p27 protein level compared to the DMSO control whereas U0126 had no effect.C:LY294002 decreased p27 content in the cytoplasm and increased p27 in the nuclear fractions.However,the MEK inhibitor did not alter p27 distribution in HCCC-8910 cells.The immunblots for RCC1 and alpha tubulin show appropriate distributions in the nuclear and cytoplasmic fractions,indicating purity of the fractions.(1)P<0.01,vs.DMSO group.

图1PI3K抑制剂通过增加p27入核引起胆管癌

HCCC-9810细胞株发生G1期细胞阻滞

Fig 1Inhibitor of PI3K induces G1 phase arrest and increases

nuclear p27 accumulation in HCCC-9810 cell lines

Akt依赖性的p27蛋白再定位参与G1期细胞阻滞与对照组相比,突变激活Akt载体可诱导细胞中Akt蛋白含量增加(图2B),显示Myr-Akt工作良好。相对于转染空质粒组,LY294002对转染GFP细胞的G1期细胞数目并没有影响;而在共转染Myr-Akt和GFP的细胞中,Myr-Akt增加了Akt总量,LY294002降低了G1期的细胞数目(图2A,P=0.007 8)。这些数据表明,Akt的过度表达解除了LY294002诱导的G1期阻滞。

进而,我们研究Akt对p27在细胞内的定位情况。Myr-Akt载体诱导细胞高表达Akt,dn-Akt降低Akt表达,收集各组细胞的细胞质、细胞核蛋白进行免疫印迹试验。结果显示高表达Akt的胆管癌细胞中,p27在细胞质中含量增加,而在细胞核中含量减少;相反,在低表达Akt的胆管癌细胞中p27在细胞质中含量减少，在细胞核中含量增加(图2C)。上述数据表明,Akt可导致p27再定位到细胞质中,从而参与到G1期细胞阻滞的过程。

A:The representative of immunoblotting of Akt in cells transfected with Myc-Akt or dn-Akt.B:The percentage number of cells in G1 arrest due to LY294002 in cells transfected with empty vector,GFP or co-transfected with Myr-Akt.C:The representative of immunoblotting of p27 in the cytoplasm and nucleus in cells transfected with Myc-Akt or dn-Akt,treated with LY294002 or not.(1)P<0.01,vs. Control group.

图2Akt依赖性的p27在HCCC-9810细胞内再

定位缓解LY294002诱导的G1期细胞阻滞

Fig 2Akt relieves G1 arrest induced by LY294002

through Akt-dependent p27 subcellular

localization in HCCC-9810 cells

Akt磷酸化p27蛋白第157位苏氨酸引起p27出核为了解Akt引起p27细胞内再定位的机制,我们采用免疫荧光染色观察p27的细胞内定位(图3A)。结果显示,细胞转染野生型p27时,p27蛋白几乎完全定位在细胞核;细胞转染野生型p27和Myr-Akt载体,p27蛋白在细胞质和细胞核中均有分布;而细胞同时转染第157位苏氨酸磷酸化位点突变的p27(p27-T157A)和Myr-Akt载体时,p27蛋白仍主要分布在细胞核内。

进而，我们采用定量方法检测p27在细胞质和细胞核中的表达量(图3B)。在转染野生型p27的细胞中，增加Akt的表达可增加p27在细胞质中的含量并降低其在细胞核中的含量。相反,在细胞中转染第157位苏氨酸磷酸化位点突变的p27,Akt的表达对p27的分布影响不大。数据表明Akt依赖性的p27重定位需要p27在第157位点磷酸化后才能出核,从而影响其对细胞周期的阻滞作用。

A:The representative image of immunofluorescence staining of p27,Akt in HCCC-8910 cell lines.B:The Quantitative content of p27 distributed in nucleus and cytoplasm in cells transfected with p27 or p27-T157A,with Akt or not.Scale bar=10 μm.

图3p27细胞内再定位依赖于Akt磷酸化p27

第157位苏氨酸

Fig 3Akt-dependent phosphorylation of p27 at T157

causes p27 accumulation in the cytoplasm

Akt通过磷酸化p27第157位苏氨酸解除LY294002的G1期阻滞突变激活表达的Akt可以逆转HCCC-9810的细胞周期阻滞,是由于野生型p27蛋白所诱导,而不是磷酸化缺失的p27突变体。

相比转染空载体,转染野生型p27蛋白能增加细胞在G1期的数目。野生型p27蛋白与Akt的共表达能降低G1期的细胞数目(P=0.006 7)。相比转染空载体,转染第157位苏氨酸突变的p27蛋白不仅能诱导G1期细胞增多,还阻断了Akt降低G1期细胞数目的功能。结果提示,Akt引起p27蛋白在第157位点的磷酸化导致p27出核,并抑制了其G1期细胞阻滞的特性,从而促进了细胞生长(图4)。

The percentage number of cells in G1 arrest in cells transfected with p27,p27-T157A or Myr-Akt.(1)P<0.01.

图4Akt通过磷酸化野生型p27第157位苏氨酸解除LY294002

对胆管癌细胞HCCC-9810的G1期阻滞

Fig 4Akt rescues HCCC-9810 cells from the cell-cycle

delay induced by LY294002 through wild-type p27

phosphorylation at Thr157

讨论

本研究在胆管癌中探对了Akt和p27调控肿瘤细胞生长的机制。结果显示抑制PI3K/Akt信号通路可诱导细胞发生G1期阻滞,同时p27蛋白在细胞核内表达增加,这种细胞周期阻滞可被上调的Akt所解除,p27在细胞核内的表达也相应减少,后续实验进一步证实Akt是通过p27蛋白Thr157位点磷酸化诱导出核,出核的p27和细胞周期蛋白结合后转换到促细胞周期进展的模式。我们认为胆管癌细胞生长失调是由于PI3K/Akt信号通路的失调,导致p27磷酸化水平降低,p27细胞质移位导致丧失其生长抑制的特性,从而促进肿瘤细胞生长。

胆管癌是多基因、多因素共同作用的结果,PI3K/Akt信号通路的失调对细胞增殖、凋亡具有重要的调控作用[4],在维持细胞恶性生物学行为中起重要作用。Akt作为PI3K的下游靶蛋白,是PI3K/Akt信号通路的核心,目前认为Akt的活性调节主要依赖于PI3K,Ser473和Thr308位点的磷酸化是Akt激活的必要条件,磷酸化Akt(pAkt)是PI3K/Akt信号通路的效应核心。磷酸化的pAkt可通过诱导抗凋亡蛋白的表达以及磷酸化凋亡调节蛋白从而抑制肿瘤细胞凋亡[5]。PI3K/Akt信号通路主要激活途径是带有磷酸化位点的结构域与磷脂分子PIP3(磷脂酰肌醇3磷酸)结合后将PI3K亚单位p85募集到近细胞膜附近,p85磷酸化是PI3K激活的启动及激活因子,从而进一步激活增殖及凋亡相关基因,改变细胞周期,调控肿瘤细胞的生物学行为[6-7]。pAkt处于细胞内多种信号途径的交汇点,通过激活或抑制下游30余种靶蛋白,参与多种细胞活动及物质代谢调节,尤其与促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、调控细胞周期等密切相关[8]。PI3K/Akt可通过mTOR来磷酸化eIF4E和p70S6K,影响细胞增殖,PI3K抑制剂可抑制mTOR,发生G1期阻滞,影响肿瘤细胞生长[8-9]。Akt升高还可激活p21激酶Pak1,继而调节p21活性,导致细胞增殖[10];也可直接磷酸化p27,使其在细胞内堆积,防止其对细胞周期的阻滞作用[11]。LY294002通透细胞后特异性抑制PI3K/Akt信号途径,包括Akt的磷酸化,我们的研究显示LY294002可引起胆管癌细胞HCCC-9810发生G1期阻滞。这种G1期阻滞还伴有p27蛋白在核内分布的增多,这种细胞阻滞也可被外源增加的Akt所解除,同时,p27蛋白在细胞核内的分布也相应减少。这提示p27蛋白在PI3K/Akt通路调控细胞周期、促进细胞增殖中发挥一定的作用。

p27是一种相对分子质量为27 000的细胞周期抑制性蛋白[12],它能与cyclinE/CDK2、cyclinD/CDK4复合物紧密结合,其基因定位于12号染色体的12p12.0～12p13.1之间,含有3个外显子和1个内含子[13]。p27蛋白分子的N端含有2个丝氨酸磷酸化位点,介导CDK激酶活性的抑制;C端含有2个苏氨酸磷酸化位点,与抑制H1组蛋白磷酸化有关。p27是CDK1重要的家族成员,可以结合Cyclin D/CDK复合物,是细胞周期的负调控因子[14]。p27蛋白在胆管癌中通常也是低表达状态,且p27水平与预后相关,高表达组生存期更高[15-16]。Shiraso等[17]针对p27设计的缺失Jab1结合区域的p27-jab-d有抑制胆管癌细胞生长的作用。受到恶性增殖信号的刺激,细胞中p27的蛋白表达水平下降,这是由于其合成下降,同时蛋白翻译后泛素蛋白酶体降解速度也提高[18]。p27蛋白水平功能的下降削弱了其对CDK或cyclin/CDK复合物活性的抑制效应,导致CDK的活化效应递增,使细胞能够完成细胞周期G1到S期的重要转换,驱动细胞周期的运行。Akt也可以使p27的Ser10位点、Thr187位点以及Thr157位点发生磷酸化,并且Thr157位点位于p27的细胞核内定位信号区域中。当PKB磷酸化p27的Thr157位点后,p27不能进入细胞核内发挥G1期阻滞的作用[11],而使细胞增殖、分裂过快、过多并导致肿瘤形成。我们的实验结果也显示,在胆管癌细胞中,Akt激活后通过磷酸化p27的Thr157位点从细胞核进入细胞质,从而丧失抑制细胞周期的功能,促进细胞生长。

正常胆管上皮细胞中,细胞周期蛋白依赖性的细胞生长是通过p27蛋白与cyclin/CDK在细胞核中的相互作用而抑制的。在胆管癌细胞中,各类生长因子和细胞因子通过细胞膜受体,激活PI3K/Akt信号通路,磷酸化的Akt可导致核内的p27蛋白在T157位点磷酸化,触发p27蛋白的核移出,使得p27与cyclinE/CDK2、cyclinD/CDK4复合物解离,细胞转换到促细胞周期进展的模式,导致分裂加快、肿瘤形成。我们认为,下调Akt或突变p27第157磷酸化位点,均可调控p27的亚细胞定位,达到G1期阻滞、抑制增殖的目的,可作为胆管癌治疗的靶点之一。

参考文献

[1]RIZVI S,GORES GJ.Pathogenesis,diagnosis,and management of cholangiocarcinoma[J].Gastroenterology,2013,145(6):1215-1229.

[2]RIQUELME I,SAAVEDRA K,ESPINOZA JA,etal.Molecular classification of gastric cancer:Towards a pathway-driven targeted therapy[J].Oncotarget,2015,6(28):24750-24779.

[3]LI L,WEI XH,PAN YP,etal.LAPTM4B:a novel cancer-associated gene motivates multidrug resistance through efflux and activating PI3K/AKT signaling[J].Oncogene,2010,29(43):5785-5795.

[4]SCHWEITZER N,VOGEL A.Systemic therapy of cholangiocarcinoma:From chemotherapy to targeted therapies[J].BestPractResClinGastroenterol,2015,29(2):345-353.

[5]CHAO X,ZAO J,XIAO-YI G,etal.Blocking of PI3K/AKT induces apoptosis by its effect on NF-kappaB activity in gastric carcinoma cell line SGC7901[J].BiomedPharmacother,2010,64(9):600-604.

[6]DINAVAHI SS,PRASANNA R,DHARMARAJAN S,etal.A novel,potent,small molecule akt inhibitor exhibits efficacy against lung cancer cellsinvitro[J].CancerResTreat,2015,47(4):913-920.

[7]SHEN G,RONG X,ZHAO J,etal.MicroRNA-105 suppresses cell proliferation and inhibits PI3K/AKT signaling in human hepatocellular carcinoma[J].Carcinogenesis,2014,35(12):2748-2755.

[8]BECK JT,ISMAIL A,TOLOMEO C.Targeting the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway:an emerging treatment strategy for squamous cell lung carcinoma[J].CancerTreatRev,2014,40(8):980-989.

[9]NERI LM,CANI A,MARTELLI AM,etal.Targeting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in B-precursor acute lymphoblastic leukemia and its therapeutic potential[J].Leukemia,2014,28(4):739-748.

[10]KIM MS,KIM JE,LIM DO Y,etal.Naproxen induces cell-cycle arrest and apoptosis in human urinary bladder cancer cell lines and chemically induced cancers by targeting PI3K[J].CancerPrevRes(Phila) ,2014,7(2):236-245.

[11]SHIN I,YAKES FM,ROJO F,etal.PKB/Akt mediates cell-cycle progression by phosphorylation of p27(Kip1) at threonine 157 and modulation of its cellular localization[J].NatMed,2002,8(10):1145-1152.

[12]POLYAK K,KATO JY,SOLOMON MJ,etal.p27Kip1,a cyclin-Cdk inhibitor,links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest[J].GenesDev,1994,8(1):9-22.

[13]PIETENPOL JA,BOHLANDER SK,SATO Y,etal.Assignment of the human p27Kip1 gene to 12p13 and its analysis in leukemias[J].CancerRes,1995,55(6):1206-1210.

[14]YOON MK,MITREA DM,OU L,etal.Cell cycle regulation by the intrinsically disordered proteins p21 and p27[J].BiochemSocTrans,2012,40(5):981-988.

[15]LUO J,ZHOU Y,WANG B,etal.Immunohis-tochemically detected expression of Skp2,p27 kip1,and p-p27 (Thr187) in patients with cholangiocarcinoma[J].TumourBiol,2015,36(7):5119-5125.

[16]WATANABE A,SUZUKI H,YOKOBORI T,etal.Stathmin1 regulates p27 expression,proliferation and drug resistance,resulting in poor clinical prognosis in cholangiocarcinoma[J].CancerSci,2014,105(6):690-696.

[17]SHIRASO S,KATAYOSE Y,YAMAMOTO K,etal.Overexpression of adenovirus-mediated p27kip1 lacking the Jab1-binding region enhances cytotoxicity and inhibits xenografted human cholangiocarcinoma growth[J].AnticancerRes,2009,29(6):2015-2024.

[18]JARNAGIN WR,KLIMSTRA DS,HEZEL M,etal.Differential cell cycle-regulatory protein expression in biliary tract adenocarcinoma:correlation with anatomic site,pathologic variables,and clinical outcome[J].JClinOncol,2006,24(7):1152-1160.

Akt induces cell growth through phosphorylation p27 in cholangiocarcinoma cell

WANG Feng1, HU Qi-li2, LI Jian2, ZHAO Yan1, LIU Hua1, TANG Mao-chun1, XIA Xiao-jun1,MENG Hong-bo2, SONG Zhen-shun2, XU Xiao-rong1△

(1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofGeneralSurgery,ShanghaiTenthPeople′sHospital,TongjiUniversity,Shanghai200072,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms for Akt and p27 in control of cholangiocarcinoma cell growth.MethodsMutationally activated Akt,dominate negative Akt,empty vector and phosphorylation deficient p27 were used in our study.Cholangiocarcinoma HCCC-9810 cells were treated with the above vectors,proteins or PI3K inhibitor.The cell cycle was measured by flow cytometry.The protein level and distribution of p27 were detected by Western blot and immunofluorescence.ResultsLY294002,an inhibitor of PI3K,induced G1 phase arrest in cholangiocarcinoma cell lines and increased p27 into the nucleus.Akt released LY294002-induced G1 phase arrest through increasing cytoplasmic p27 protein level.Akt reversed cells from the cell cycle arrest through wild type p27 phosphorylation at Thr157.ConclusionsAkt induced p27 phosphorylation at Thr157 and p27 relocalization to an extranuclear subcellular distribution in cholangiocarcinoma cells.

【Key words】cholangiocarcinoma;p27;Akt;phosphorylation;cell cycle

【中图分类号】R753.8

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.003

(收稿日期:2016-01-29;编辑:王蔚)

国家自然科学基金(81472578,81570578); 上海市自然科学基金(15ZR1432800)

△Corresponding authorE-mail:xuxr@tongji.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81472578,81570578) and the Natural Science Foundation of Shanghai,China (15ZR1432800).