张小建，李晓洁，廖梅旭，彭礼繁，余 鲲，曹雪华，贾彦全，邓 芳，吕 群

(四川省医学科学院·四川省人民医院妇产科辅助生殖医学中心，四川 成都 610072)

冻融胚胎移植周期中不同发育阶段胚胎妊娠结局比较

张小建，李晓洁，廖梅旭，彭礼繁，余 鲲，曹雪华，贾彦全，邓 芳，吕 群

(四川省医学科学院·四川省人民医院妇产科辅助生殖医学中心，四川 成都 610072)

目的 探讨冻融胚胎移植周期中不同发育天数胚胎的发育潜能，为进一步提高FET妊娠率提供依据。方法 627例患者830个复苏周期胚胎，根据冷冻时间不同，分为 D3 冷冻组(n=385)，D5 冷冻组(n=300)和 D6 冷冻组(n=145)，待患者内膜达到8～12 mm 时，复苏18～20 h(D3胚胎)或2～3 h(D5/D6)后移植。结果 移植胚胎数，D3组显著高于D5和D6组(P< 0.05)，D5冷冻组的临床妊娠率和着床率均显著高于 D6 冷冻组(61.67% vs 51.03%，46.37% vs 37.94%，P< 0.01)和D3冷冻组(61.67% vs 40.26%，46.37% vs 24.57%，P< 0.01)，多胎妊娠率，D5>D6>D3组(P< 0.01)。结论 在患者有较多胚胎的情况下，进行囊胚培养冷冻，选择囊胚进行冷冻周期移植能够取得更好的临床结局。

冻融胚胎移植；玻璃化冷冻；临床妊娠率；着床率

冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)作为体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)技术的重要补充，在提高累积妊娠率、降低多胎率和预防卵巢过度刺激综合征等方面起着重要作用。同时对某些特殊病例，比如取卵当日无法获得精子等，采用玻璃化冷冻技术冷冻卵子，是避免取消周期的最佳方法[1]。影响FET成功率的因素很多，一般认为胚胎因素更重要。囊胚阶段的胚胎由于其本身经过体外培养的优选，具有更高的临床妊娠结局。但是分裂期胚胎由于具有较多胚胎数量，能够有更多的移植机会，同样也能够通过增加移植次数来为患者带来理想的妊娠结局。本研究回顾性分析我中心2014月1月至2015年6月830个FET周期的临床资料，探讨冷冻时机和胚胎因素对FET结局的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年1月至2015年6月在我中心接受FET治疗的627例患者(830个周期)，均因输卵管盆腔因素及男方因素接受辅助生殖治疗。根据胚胎发育阶段分为D3组(n=385)、D5组(n=300)和D6组(n=145)。患者在取卵后第三天决定是否行新鲜周期移植，将剩余的胚胎根据患者知情选择情况进行D3天冷冻或行囊胚培养至D5或D6，将养成的可利用囊胚再次冷冻。三组中原发不孕、平均不孕年限比较差异无统计学意义(P> 0.05)。

1.2 方法 ①所有患者采用黄体期长方案或月经第二天短方案进行治疗，促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)抑制剂(Orgalutran，NV Organon)联合重组促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH)，超排卵，当两个以上卵泡> 18 mm 时，给予250～500 μg 人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)，36～38 h 取卵，取卵日为D0。②授精:胚胎培养和胚胎选择卵母细胞收集后放置于G-IVF溶液中进一步成熟培养大约4 h，常规体外授精或ICSI。ICSI 操作最晚在hCG注射后42 h 前进行。授精16～18 h 后观察受精情况。将受精卵培养在分裂期培养液中继续培养直至移植。当胚胎培养到Day3会根据患者内膜等因素决定是否施行新鲜周期移植，不管移植与否都会对患者进行知情告知，对胚胎进行冷冻或者继续培养至囊胚阶段(Day5/Day6)后再冷冻。③胚胎冷冻:所有阶段的胚胎均采用相同的冷冻方法，具体步骤为:胚胎在G-MOPS缓冲液中清洗后放入分别含7.5%(v/v)二甲基亚砜和乙二醇的平衡液中放置2 min，然后将胚胎转移到分别含15%二甲基亚砜和乙二醇的玻璃化液中清洗3～5 次，然后放置到载体，迅速放入液氮，胚胎在玻璃化液中的处理时间不超过45s。每个冷冻载体胚胎放置数量不超过3枚。④胚胎解冻:D3 的分裂期胚胎于移植前一天下午进行，解冻溶液采用G-MOPS缓液为基础液，胚胎从液氮中取出放入0.8mol/L 蔗糖溶液1 min，0.6 mol/L 1 min，0.33 mol/L 2 min，0.2 mol/L 3 min，然后胚胎转入基础液中5 min，移入囊胚培养液培养直至移植。D5/D6的囊胚解冻于移植日当天进行，方法为，首先在0.33 mol/L的蔗糖溶液中2 min，0.2 mol/L蔗糖溶液3 min，然后胚胎转入基础液中5 min，移入囊胚培养2～3小时后移植。解冻操作温度均为37 ℃。胚胎解冻后，半数及以上的卵裂球存活，定义为胚胎存活；没有卵裂球损伤，定义为全胚胎存活。移植日观察胚胎发育情况，若卵裂球较解冻日增加，则定义该胚胎继续发育。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0 统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示，方差分析及q检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。P< 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

移植胚胎数，D3组显著高于D5和D6组(P< 0.05)，D5冷冻组的临床妊娠率和着床率均显著高于 D6 冷冻组(均P< 0.01)，多胎妊娠率，D5和D6组极显著高于D3组(P< 0.01)，同时D5组显著高于D6组(P< 0.05)，见表1。

表1 三组妊娠结局比较

3 讨论

近年来FET逐渐成为辅助生殖技术的重要组成部分，也有越来越多的学者致力于研究影响FET成功率的因素，但结论不尽一致。目前全胚冷冻后择期FET是卵巢过度刺激综合征(OHSS)高危倾向、HCG日血孕酮值升高、子宫内膜薄等一些不适合新鲜周期移植的患者，减少OHSS等并发症发生，提高种植率，改善妊娠结局的重要措施。对于部分全胚冷冻患者，特别是OHSS高危患者，获卵数多，可利用胚胎相对多，冷冻需时间长、费用高。如能在确保患者妊娠率的前提下，行囊胚培养后冷冻，则能减少可利用囊胚的冷冻数目，降低冷冻费用，同时也为单囊胚移植、避免多胎妊娠提供了可能。本研究着重分析冷冻时机及胚胎因素对FET结局的影响。

受精后冷冻胚胎时机对妊娠结局的影响，目前尚无统一标准。学者对此做了研究，结论尚不统一，有研究发现合子期，受精后D2和D3胚胎的复苏率差异有显著性，认为冷冻时胚胎的发育阶段对复苏率有明显影响，但对临床妊娠率几乎无影响[2]。但是，本文中比较的D3，D5和D6胚胎，在复苏存活率方面差异无统计学意义，但是临床妊娠率差异有统计学意义。尽管本文中比较的胚胎发育阶段与SALUMETS的不同，但是有一点可以肯定的是，胚胎从合子期到囊胚期，由于培养时间的延长，更有利于选择优质胚胎进行移植，对提高妊娠率也是有明显益处的。但是胚胎存活率由于选择的冷冻方法目前有了较大的改进，特别是玻璃化冷冻法应用以来，对于各个发育阶段的胚胎都能够获得一个较高的复苏存活率。

尽管目前FET周期胚胎和囊胚移植的临床效果尚存在争议，但越来越多研究认为FET周期囊胚移植能获得良好的妊娠结局，在辅助生殖技术(ART)助孕中具有良好的应用前景[3]。任新玲等[4]认为，囊胚发育速度对妊娠结局无影响，即使囊胚发育速度较慢，D6 天才形成3期以上囊胚，复苏后移植对妊娠率也无不良影响。然而，李城等[5]研究认为在冷冻复苏的单囊胚移植周期中，D5囊胚移植的生化妊娠率和临床妊娠率和种植率均显著高于D6囊胚。从本研究结果也可看出，D5天囊胚的临床妊娠率和着床率都显著高于D6天囊胚。就其原因，Desai 等[6]认为即便是质量较好、完全扩张的 D6囊胚，相对于D5囊胚，由于囊胚细胞数的增加，导致更多的新陈代谢活动和更大的囊胚腔，这些因素都可能对玻璃化冷冻复苏的过程和结果造成影响。

本研究结果显示，D5、D6的囊胚临床妊娠率和着床率均显著高于D3的分裂期胚胎，但这仅是对有囊胚移植患者进行的统计分析，部分患者因为没有囊胚形成而没有再次移植的机会，一定程度上对患者进行了筛选。因此，在临床治疗过程中，在具备稳定的囊胚培养条件前提下。通过对患者的有效沟通，告知进行囊胚培养的有利于减少移植次数，增加每次移植的妊娠几率，但是会减少胚胎利用率。在患者充分知情的前提下提倡进行囊胚培养。

[1] 耿洁，胡玉琴，刘兰兰.卵子玻璃化冷冻在体外受精-胚胎移植取精失败周期中的应用[J].实用医院临床杂志，2014，11(1):156-157.

[2] 柳朝华，高士友，邓朝晖，等.胚胎因素对冷冻胚胎移植周期结局的影响[J].海南医学院学报.2010，(16)5:604-607.

[3] Healy MW，Patounakis G，Connell MT，et al.Does a frozen embryo transfer ameliorate the effect of elevated progesterone seen in fresh transfer cycles[J].Fertil Steril，2015[Epub ahead of print].

[4] 任新玲，章汉旺，刘群，等.复苏周期单囊胚移植的影响因素分析[J].华中科技大学学报，2011，40(6):743-745.

[5] 李城，李梅，马水英，等.不同发育天数冻融单囊胚移植的临床结局比较[J].现代妇产科进展，2014，23(2):121-123.

[6] Desai NN，Goldberg JM，Austin C，et al.The new Rapid-i carrier is an effective system for human embryo vitrification at both the blastocyst and cleavage stage[J].Reproductive Biology & Endocrinology，2013，11(3):1-9.

Q813.7

A

1672-6170(2016)02-0123-03

2015-10-16；

2015-11-16)