刘　东　赵　敏

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江　哈尔滨　150040）



一种野生羊肚菌的鉴定与不同部位菌丝分离保藏*

刘东赵敏**

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040）

摘要：通过提取野生羊肚菌属真菌子实体总DNA，并对其ITS序列进行扩增、测序和分析鉴定的结果表明：该菌株为尖顶羊肚菌；通过对晾干后子实体不同组织部位（菌顶、菌柄、子实体根部）菌丝ITS序列的分析证明：从菌顶和菌柄分离得到的菌丝序列与子实体一致，但从子实体根部分离得到的菌丝为海绵共附生真菌；其中菌柄组织的菌丝成活率最高，且组织萌发最快，更容易得到菌丝。

关键词：食用菌；分离；鉴定；ITS

*国家林业局948项目（2012-4-03）资助

近年来羊肚菌属真菌（Morchella conica）被作为营养保健食品而倍受人们的青睐，致使其被过度采摘。鉴于羊肚菌子实体存在组织脆嫩、极易染菌而腐烂变质的问题，对该菌种质资源的分离和保藏迫在眉睫［1-3］。本研究利用简便、快速、客观的ITS序列分析方法对晾干后的野生羊肚菌属真菌子实体进行鉴定［4-5］，同时对晾干后子实体的不同组织部位（菌顶、菌柄、子实体根部）进行菌丝分离并鉴定，从而为菌种的准确严谨保藏，以及完善野生食用菌的分离和保藏提供了科学的方法。

1材料与方法

1.1试验材料

野生菌于2014年5月采自辽宁省宽甸县石湖沟村山丘上的灌木林中，晾干待用。通过形态学初步鉴定该野生食用菌为羊肚菌属真菌。

1.2试验方法

1.2.1菌体总DNA提取

参照改进CTAB法［6］提取子实体的总DNA，用1％的琼脂糖凝胶检测DNA样品的质量和浓度。

1.2.2 ITS基因扩增及纯化

PCR反应引物：采用ITS序列的通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTC CGCTTATTGATATGC。

50 μL反应体系：引物各2 μL；模板1 μL；20 Mm/LdNTP 4 μL；10×PCR buffer 5 μL；5 U/μL TaqDNA聚合酶（全式金）0.2 μL；ddH2O 35.8 μL。

反应条件：94℃4 min；94℃30s，54℃30s，72℃1 min，30个循环；72℃10 min。用1％的琼脂糖凝胶以DL2 000为marker，对PCR产物进行电泳检测。

1.2.3序列测定

采用PCR产物克隆测序，将PCR产物纯化，与pEASY-T1 Cloning Vector连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用含有Amp的LB平板进行菌落筛选培养，PCR检测。克隆成功后，菌液委托北京金唯智生物科技公司双向测序。

1.2.4组织分离及分离菌丝的ITS序列鉴定

分离培养基选用武冬梅的PDA固体分离培养基［7］，将晾干的野生食用菌子实体放入已灭菌的超净工作台上，用柳叶刀对子实体的菌顶、菌柄和子实体根部进行分离。然后将切好的组织小块依次放入70％乙醇30s、0.1％HgCl 30s、70％乙醇30s、无菌水30s灭菌。处理后放入无菌水中，再将其分别接种于PDA固体培养基中，在27℃恒温培养箱中培养，观察记录菌丝状态及成活率。每个处理重复9次，并将不同组织部位分离得到的菌丝转接到固体PDA斜面培养基上进行菌种保藏。同时将不同组织部位分离获得的菌丝，转接到液体PDA培养基中，在27℃，140 rpm条件下进行培养，液体培养5～6天后，分离菌体，参照上面改进CTAB法提取子分离菌丝的总DNA，利用上述ITS鉴定方法对不同组织部位分离菌丝进行测序鉴定。

2结果与分析

2.1野生食用菌子实体ITS序列测序结果比对

将野生食用菌子实体ITS序列提交NCBI进行Blast比对分析，其中登录号为EF080999的序列与野生食用菌ITS序列相似度为92％，经查阅文献确定此菌株为尖顶羊肚菌（Morchella conica）。

2.2分离部位对菌丝成活的影响

由野生食用菌不同分离部位的菌丝成活及生长状态（表1）可知：子实体菌柄分离得到的菌丝萌发最快，其次为子实体根部，菌顶处最差；菌丝萌发率最高的为菌柄部分，其次为子实体菌根；从菌顶与菌柄分离得到的菌丝均为黄白色绒毛状，而子实体根部则为灰白色绒絮状菌丝。液体培养中，菌柄分离得到的菌丝生长最快且均匀，菌顶分离得到菌丝生长较慢。

表1　野生食用菌不同分离部位的菌丝成活和菌丝生长状态

2.3野生食用菌ITS基因扩增结果分析

由野生食用菌和不同部位分离得到菌丝的ITS片段PCR产物电泳图（图1）可以看出：所有样品的ITS序列扩增产物均获得明亮单一条带，且分子量在750 bp左右，符合ITS序列的长度，可用于进一步测序分析。

2.4测序结果比对与分析

将菌顶、菌柄和子实体菌根分离得到的菌丝扩增ITS序列，即X1、X2、X3序列交NCBI进行Blast比对分析（表2），其中菌顶和菌柄序列比对结果与子实体序列结果一致，均为尖顶羊肚菌（Morchella conica.），子实体根部所获得的菌丝则为海绵共附生真菌。

图1　野生食用菌和不同部位分离获得菌丝的ITS片段PCR产物电泳图注：M为Marker DL2000；X为野生食用菌子实体扩增ITS片段；X1、X2、X3为菌顶、菌柄和子实体根部分离所得菌丝扩增ITS片段

表2　野生食用菌不同分离部位对菌丝生长状态的影响和分子鉴定结果比对

3结论

3.1利用简单、快捷的ITS序列对未知野生食用菌进行鉴定得到，该野生食用菌为尖顶羊肚菌（Morchella conica）。

3.2利用不同组织部位分离方法对晾干的野生食用菌子实体进行菌丝分离，结果表明：菌顶和菌柄的萌发率分别为20％、50％，染菌率很低，菌丝状态为黄白色绒毛状；而子实体根部虽然萌发率高达40％，染菌率却很高，菌丝状态为灰白色绒絮状。

3.3通过对所获得的菌丝进行液体培养和ITS序列扩增分析表明，菌顶和菌柄分离得到的菌丝为尖顶羊肚菌（Morchella conica），子实体菌根则为其他共生杂菌，说明在菌丝分离过程中对分离菌丝进行分子鉴定是必要的。

3.4不易保存的野生真菌可以通过简单的晾干后再对子实体进行分离也可以得到萌发菌丝，通过分子鉴定方法进一步鉴定能更准确的获得正确菌丝，这为以后野生食用菌种质资源的鉴定与分离保藏提供重要的参考，使菌种质资源的保藏更加系统化。

参考文献

［1］赵琪，康平德，戚淑威，等.羊肚菌资源现状及可持续利用对策［J］.西南农业学报，2010（1）：266-269.

［2］杨槐俊，郭素萍，尤利霞，等.山西特殊名优真菌分离培养及原生态扩繁［A］.中国菌物学会、中国农学会食用菌分会.第九届全国食用菌学术研讨会摘要集［C］.中国菌物学会、中国农学会食用菌分会，2010：1.

［3］付绍春，谭琦，尚晓冬，等.野生食用菌种质资源采集过程中应注意的几个问题［A］.中国菌物学会、中国农学会食用菌分会.第九届全国食用菌学术研讨会摘要集［C］.中国菌物学会、中国农学会食用菌分会，2010：1.

［4］罗晓莉，朱立，张微思，等.野生食用菌保鲜技术研究概况及发展趋势［J］.食品研究与开发，2012（2）：200-202.

［5］燕勇，李卫平，高雯洁，等.rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用［J］.中国卫生检验杂志，2008（10）：1958-1961.

［6］吴发红，黄东益，黄小龙，等.几种真菌DNA提取方法的比较［J］.中国农学通报，2009（8）：62-64.

［7］武冬梅，许文涛，谢宗铭，李全胜，罗云波.新疆伊犁昭苏野生羊肚菌分离株的分子鉴定研究［J］.北方园艺，2014 （21）：145-148.

（责任编辑：李丹）

Separation and Preservation of Different Parts of a Morchella esculenta and Its Identification

LIUDong
（College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Heilongjiang Harbin 150040）

AbstractGenomic DNA was extracted from fruiting body then used as template for the ITS gene PCR amplification.Different air-dried fruit body parts of the wild edible mushroom（pileus，stipe，fruiting body root）was isolate and identify.The results show that，it was Morchella conica（EF080999）by the rDNA ITS sequence analysis.“PCR”should be revised to“Sequencing”analysis showed that the separated mycelium of pileus and stipe which came from the wild fungus's fruiting body.But the separated mycelium of fruiting body root is Hansfordia sp.；The survival rate of organization of the stipe was the highest and the stipe germinated was the fastest.

Key wordsEdible fungi；Isolation；Identification；ITS

中图分类号：S567.3+9

文献标识码：A

文章编号：1001-9499（2016）03-0027-03

作者简介：第1刘东（1988-），男，硕士，主要从事大型真菌鉴定和漆酶分子生物学及其降解污染物等研究工作。

通讯作者：赵敏（1964-），男，博士，教授，主要从事污染物降解微生物、漆酶分子生物学及其降解污染物等研究工作。

收稿日期：2016-03-11