苏建明，郝春凤，李孟楼

(1 西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100;2大连市林业有害生物防治检疫局，辽宁 大连116023)



花绒寄甲雌性生殖系统的解剖结构

苏建明1,2，郝春凤1，李孟楼1

(1 西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100;2大连市林业有害生物防治检疫局，辽宁 大连116023)

[摘要]【目的】 揭示花绒寄甲(Dastarcus helophoroides (Fairmaire))雌性生殖系统解剖结构在生殖过程中的变化规律及其与产卵量的关系，为从分子水平研究其生殖衰老过程提供形态学依据。【方法】 利用光学显微镜和扫描电镜，解剖观察了独立饲养1～12年龄组的花绒寄甲雌成虫生殖系统，同时比较了各年龄组的产卵量。【结果】 花绒寄甲雌性生殖系统由卵巢、侧输卵管、中输卵管、受精囊、受精囊腺、囊状膨大的生殖附腺和外生殖器构成；每个卵巢萼部有萼头11个，每萼头连接6或8根卵巢管，整个卵巢平均有卵巢管约70根；卵巢管的结构从端部至基部可分为端丝、原卵区、生殖区和卵巢管柄；随雌成虫存活年份的增加，卵巢管原卵区长度和直径有缩短现象，部分卵巢管出现蚀空性病变(无内含物，只有管壁)，日产卵量自羽化后第4年明显下降。【结论】 花绒寄甲雌性生殖系统具有囊状膨大的生殖附腺，随成活年份的增加产卵量的衰减与卵巢管的衰老有关，人工大量繁育时自第4年开始应及时淘汰和更新种群。

[关键词]花绒寄甲；雌成虫；生殖系统；解剖结构

花绒寄甲Dastarcushelophoroides(Fairmaire)隶属于鞘翅目Coleoptera穴甲科Bothrideridae[1-2]。该虫为中国和日本所特有，主要分布于东经105°～135°，北纬 30°～40°，是钻蛀性食木害虫光肩星天牛、松褐天牛等天牛的寄生性天敌[3-6]。研究发现，用不同寄主饲养的花绒寄甲个体大小有差异，寄生于天牛蛹上的花绒寄甲羽化率最高、体型较大、卵巢管数较多、成虫产卵率高[4-11]。Togashi等[12]对花绒寄甲生殖系统的初步研究认为，花绒寄甲雌成虫卵巢管数与体型大小之间存在正相关关系，但对于花绒寄甲生殖系统形态学描述的研究尚未见报道。花绒寄甲在天牛的防治上得到了广泛利用，如Urano[4]、 Miura等[5]利用在野外释放人工饲养的花绒寄甲成虫防治松褐天牛(Monochamusalternatus(Hope))；在中国大部分省份通过释放花绒寄甲来防治光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis(Motschulsky))、栗山天牛(Massicusraddei(Blessig))、云斑天牛(Batoceralineolata(Chevrolat))、锈色粒肩天牛(Aprionaswainsoni(Hope))等多种天牛[13-16]。

在害虫天敌繁殖、释放利用过程中，研究天敌的生殖生理学非常重要。昆虫雌性生殖系统的功能主要在于形成成熟卵子、提供受精场所、产卵等[17]，了解昆虫雌性生殖系统的结构是研究其生殖生理的首要条件。2000年至2005年李孟楼等[6,15]在持续饲养花绒寄甲的研究中发现，花绒寄甲成虫寿命长达5年以上，且还能持续产卵，但其产卵量在雌虫羽化后3年内最多，3年后产卵量急剧下降。这一现象表明，花绒寄甲成虫的寿命与生殖能力有相关性，为揭示导致其生殖力下降的原因，即生殖力与其生殖系统组织结构及其卵子发生过程产生变化的关系，本研究以花绒寄甲雌成虫为材料，利用光学显微镜和扫描电镜解剖观察了独立饲养1～12年龄雌成虫的生殖系统，并统计了各年龄组的产卵量，以揭示花绒寄甲雌成虫寿命与产卵量的关系，为从分子水平研究其生殖衰老过程提供形态学依据。

1材料与方法

1.1供试虫源

花绒寄甲雌成虫来自西北农林科技大学林学院森林害虫生物防治实验室。取自2000年分别独立饲养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年的花绒寄甲雌成虫各20头，按照存活年份区分为1～12年的年龄组，放置在木容器中单独饲养，每个年龄组设置3个重复饲养组，饲料由西北农林科技大学林学院森林害虫生物防治实验室配制[7-8]，饲养室日均温为(22.35±4.72) ℃，昼夜光照时间16L∶8D。在饲养过程中，逐日统计各组的产卵量，连续统计30 d。日产卵量=∑每日产卵量/30。

1.2光学显微镜观察

将活的花绒寄甲雌成虫放置在冰上冷冻麻醉，在解剖镜下用昆虫针从鞘翅与腹部间轻轻挑开薄膜，整体取下内部结构放置在表面皿上，加滴Ringer生理盐水，在双目解剖镜下用昆虫针迅速剔除生殖系统的脂肪体，然后置于体积分数70%酒精中，4 ℃保存。分批进行两组试验，分别为：① 选取完整的雌性生殖系统放置于载玻片上，滴1滴生理盐水，在Olympus光学显微镜下观察其形态结构特征并拍照。② 选取各年龄组花绒寄甲雌成虫卵巢各10个，在Olympus显微镜下选取卵巢管长度为1 mm的卵巢管30根，用测微尺测量卵巢管原卵区的长度。

1.3扫描电镜观察

取各年龄组花绒寄甲雌成虫卵巢、附腺、受精囊及新产出的卵，用体积分数2.5%戊二醛于4 ℃下固定12 h，然后进行如下操作：① 用0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)分次洗涤10，20，30 min。用体积分数30%，50%，70%，80%，90%，100%乙醇逐级脱水10，10，10，15，15 min。② 用乙酸异戊脂置换1 h，再将样品移入样品笼中，采用临界点干燥法干燥。③ 将样品粘到扫描电镜观察台上，用JFC-1600离子溅射仪喷金镀膜，GSM-6360LB扫描电镜观察和拍照。

1.4组织切片观察

将保存于体积分数70%酒精中的花绒寄甲雌成虫附腺用Bouin’s 固定液在室温下固定2 h，再利用体积分数70%，80%，90%，95%，100%，100%酒精梯度脱水各10 min，然后用二甲苯透明30 min。透明后利用不同配比二甲苯和石蜡进行透蜡，再在纯石蜡中浸透12 h，温度为60 ℃。将透蜡好的雌成虫附腺进行包埋、切片(厚度为8 μm)，用苏木精-伊红(H-E)进行染色，染色完后用中性树胶封片，对组织切片进行观察并拍照。

2结果与分析

2.1花绒寄甲雌成虫光学显微观察结果

光学显微镜解剖观察表明，花绒寄甲雌成虫生殖系统包括1对卵巢，每个卵巢萼部有萼头11个，每萼头连接6或8根卵巢管，整个卵巢有卵巢管36～158根，平均约70根(图1，图2)；花绒寄甲雌成虫2个卵巢的卵巢管数不相同，每卵巢管中均有大量的成熟卵生成，当卵成熟后有3～4个卵同时从侧输卵管中排出；2个卵巢的卵巢管柄通过卵巢萼汇入侧输卵管，侧输卵管与中输卵管相连，两个输卵管连通成“Y”字形。在中输卵管与外生殖器之间连接有受精囊与管状受精囊腺，以及1个体积大于卵巢的囊状膨大的性附腺，附腺内有内含物。

图 1花绒寄甲雌性生殖系统的光学显微特征

ov.卵巢；ovl.卵巢管；L.侧输卵管；M.中输卵管；sp.受精囊；sg.受精囊腺；ag.附腺；ovp.外生殖器；标尺=2 mm

Fig.1Optical microscopic characteristics of adult femaleDastarcushelophoroides

ov.Ovariole;ovl.Ovarioles;L.Lateral oviduct;M.Median oviduct;sp.Spermatheca;

sg.Spermathecal gland;ag.Accessory gland;ovp.Ovipositor;Scale bar=2 mm

图 2　花绒寄甲卵巢结构的扫描电镜特征

2.2花绒寄甲雌性生殖器官的扫描电镜观察

2.2.1卵巢管形态结构花绒寄甲卵巢管为细长管状结构，长约1 mm，最大直径约80 μm(图3)。卵巢管从端部至基部包括端丝、原卵区、生殖区(卵黄沉淀区和卵室)和卵巢管柄。原卵区的长度约300 μm，直径约50 μm，占卵巢管长度的近1/3。卵巢管柄表面比较粗糙，且直径较小。

图 3　花绒寄甲卵巢管的扫描电镜特征

2.2.2受精囊形态结构花绒寄甲受精囊长约80 μm，直径约40 μm(图4-A)。受精囊表面有许多交织的肌纤维(图4-B)；最外层有较发达的、排列紧密的纵肌，内层是环肌(图4-C)；肌纤维之间具有间隙非常小的结缔组织(图4-D)。

图 4　花绒寄甲受精囊的扫描电镜特征

2.2.3生殖附腺形态结构花绒寄甲生殖附腺表面交织有大量的肌纤维，肌纤维表面具有分叉的细小气管连接于肌纤维的缝隙之间。性附腺的组织切片(图5)表明，该附腺是一个壁比较厚的中空的囊状结构，其内壁有许多叶片状褶皱结构。

2.2.4卵的表面结构花绒寄甲卵为梭形，长约800 μm，最大直径约200 μm(图6-A、C)。卵壳有2层，卵壳外层结构由近似六面形的结构组成，每个六面形的中部向内凹陷(图6-B、G)；内层卵壳的表面比较光滑，且有一些网格状脊(图6-D)。在卵较粗的一端，其端部15 μm处的表面规则排列着一圈珠孔，珠孔间距约5 μm，珠孔直径约1 μm；珠孔周围的表面具有颗粒状的小球，该小球可能为精子(图6-E、F)。

2.3花绒寄甲雌成虫存活年份与卵巢管形态特征的关系

2.3.1花绒寄甲卵巢管形态随存活年份的变化随着花绒寄甲雌成虫存活年龄的增加，个别卵巢管发生了显著蚀空性病变(无内含物，只有管壁)现象(图7-A、B)。解剖发现，健康的卵巢管呈饱满的管状结构，卵巢管内部有成熟卵或正在生成卵，卵巢管长度相差不大；而发生蚀空现象的卵巢管长度明显缩短，原卵区表面出现褶皱；随着雌成虫存活年龄的增加，卵巢管的蚀空现象增多，这可能是造成产卵量下降的原因之一。

进一步观察表明，健康卵巢管总长度约1 mm，原卵区与生长区之间的分界较明显；随花绒寄甲雌成虫存活年份的增加，原卵区长度(g)和直径将出现明显变化(图8-A，存活2 年，原卵区长度300 μm；图8-B，存活6年，原卵区长度250 μm；图8-C，存活9年，原卵区长度200 μm，直径显著缩短)，表明原卵区长度随着存活年份的增加在不断缩短。

2.3.2花绒寄甲卵巢管的原卵区长度与产卵量的关系对存活1～12年花绒寄甲雌成虫连续30日的产卵量分析，同时解剖测量各年龄组成虫卵巢管原卵区长度，得到卵巢管原卵区长度与日产卵量之间的关系如图9。图9表明，存活1～12年花绒寄甲雌成虫卵巢管原卵区长度是189.5～440.5 μm，各年龄组花绒寄甲卵巢管原卵区长度差异显著(F=213.06，P<0.001)；花绒寄甲雌成虫的日产卵量和卵巢管原卵区长度随存活年份的增加而逐渐下降，原卵区长度(X)和日产卵量(Y)间关系符合Y=-8.353+0.048X(P<0.001,R2=0.835,n=12)(图10)；花绒寄甲雌成虫羽化后第4年日产卵量急剧下降，表明花绒寄甲雌成虫的生殖系统自第3年后开始急剧衰老，从而导致其生殖能力降低。

图 6　花绒寄甲卵的扫描电镜特征

3讨论

大多昆虫雌性生殖系统的卵巢管一般为2～10根[12]，卵巢管数与其体型大小呈正相关[18]。花绒寄甲雌性生殖系统的卵巢管有36～158根，卵巢管为端滋式[19]。在雌虫生殖系统中，与外生殖器相连的附腺为受精囊精子的储存提供营养[17]；与其他昆虫比较，花绒寄甲雌成虫生殖系统的附腺特别膨大，这种特殊构造可能为花绒寄甲雌成虫能够持续多年产卵提供了营养保证，但其内容物的具体成分和功能还有待进一步研究。

图 7　存活5年花绒寄甲卵巢管褶皱脱落的扫描电镜特征

图 8　不同存活年份花绒寄甲原卵区长度(g)的扫描电镜特征

卵巢管数量的多少与生殖潜能大小相关，是体现其产卵量的一个很好的指标[20]；原卵区是卵母细胞发育的区域，在卵子发生过程中卵巢管会发生细胞凋亡，从而导致原卵区长度变短[21]；果蝇卵子发生过程中营养缺失是导致卵巢管中细胞凋亡的主要原因之一，其凋亡的主要检验标志即为原卵区的滤泡细胞是否凋亡[22]；滤泡细胞在卵母细胞的发育、成熟、退化中对卵母细胞有保护、供给营养、分化出精孔细胞、形成次级卵膜、破坏并吞噬卵母细胞的功能[22]。

本研究结果表明,花绒寄甲雌成虫存活年份增加后其卵巢管原卵区的长度和直径有很大变化，部分卵巢管也会发生蚀空性病变(无内含物)，从而导致能够有效发生卵子的有效卵巢管数减少；另外，随花绒寄甲雌成虫存活年份的延长，花绒寄甲卵巢管原卵区长度和日产卵量显著降低，这种变化在羽化后第4年最为显著。蚀空性病变卵巢管数的增加、原卵区的长度和直径缩小，均是导致花绒寄甲雌成虫产卵量降低的原因；但这种变化是否与卵巢管中的细胞调亡有关，原卵区长度能否作为花绒寄甲雌成虫生理年龄的判别指标以及花绒寄甲雌成虫能够持续多年产卵是否与其具有特别膨大的性附腺能够持续提供营养有关等问题，还有待进一步深入研究。

图 9　花绒寄甲卵巢管原卵区平均长度和平均日产卵量与存活年份之间的关系

在花绒寄甲成虫羽化后区分年份和独立饲养的观察证明，花绒寄甲成虫在实验室条件下(22.35±4.72) ℃已存活了12年，且能够持续产卵；而Inoue[10]的报道中，花绒寄甲成虫寿命仅为3年。虽然花绒寄甲成虫寿命很长，但羽化后第4年产卵量明显降低，这一繁殖特征表明其生殖能力至第4年已衰退，因此在人工大量繁育时应及时进行种群的淘汰和更新。

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Female reproductive system ofDastarcushelophoroides(Fairmaire) (Coleoptera:Bothrideridae)

SU Jian-ming1，2,HAO Chun-feng1,LI Meng-lou1

(1CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China；2TheBureauofForestryPestPreventionandQuarantine,Dalian,Liaoning116023,China)

Abstract:【Objective】 The changes in female reproductive system of Dastarcus helophoroides (Faimaire) during reproductive process and the relationship with egg production were investigated.【Method】 Light microscopy and scanning electron microscopy were used to observe the reproductive system and egg production of female adults of Dastarcus helophoroides at different ages.【Result】 The reproductive system of female Dastarcus helophoroides consisted of one pair of ovaries,a pair of lateral oviducts,a median oviduct,a spermatheca,an enlarged accessory glands,and ovipositor.Each ovary had 11 calyx head and each calyx head was connected to 6 or 8 ovarioles,with a total of about 70 ovarioles.The individual ovariole consisted of four parts including terminal filament,germarium,vitellarium,and pedicel.The germarium length and diameter decreased with increase of age. Some ovarioles even dropped and the daily egg production decreased significantly since the fourth year after emergence.【Conclusion】 The reproductive system of female Dastarcus helophoroides had enlarged accessory glands and the egg production decreased with the senescence of ovarioles.Population should be eliminated and updated since the fourth year under the condition of artificial breeding.

Key words:Dastarcus helophoroides;female adult;reproductive system;anatomical structure

DOI：网络出版时间:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.014

[收稿日期]2014-08-15

[基金项目]国家自然科学基金项目(31170608)

[作者简介]苏建明(1987-)，男，辽宁大连人，硕士，主要从事森林保护研究。[通信作者]李孟楼(1957-)，男，陕西富平人，教授，博士生导师，主要从事森林害虫防治及杀虫剂毒理研究。

[中图分类号]S476.3

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)04-0100-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.028.html