卢敏白杰魏凤仙王琳燚徐彬尹清强李绍钰

（1. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002；2. 河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002）

家蝇抗菌肽diptericin基因在大肠杆菌中的表达

卢敏1，2白杰1魏凤仙1王琳燚1徐彬1尹清强2李绍钰1

（1. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002；2. 河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002）

为了实现原核表达的途径高效获取抗菌肽蛋白，以RT-PCR的方法反转录合成家蝇的抗菌肽diptericin基因，并克隆至pGEX-4T-1载体上，转化至大肠杆菌BL21宿主菌进行表达。测序结果显示，RT-PCR克隆到长345 bp的家蝇diptericin基因，重组菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，通过SDS-PAGE电泳和Western-blot检测到目的蛋白的融合表达，结果表明带有GST标签的融合蛋白大小约为37 kD，并且通过GST纯化柱纯化得到了目的蛋白。

家蝇；抗菌肽；diptericin；原核表达

抗菌肽（Antibacterial peptide）是生物体内具有免疫屏障作用的一类多肽，是天然免疫系统中不可缺少的重要组成部分［1］。自20世纪70年代末Boman等［2］首次在惜古天蚕（Hyalopbora cecropia）中发现抗菌肽天蚕素（Cecropin）以来，迄今已有1 000多种具有抗菌活性的多肽被分离鉴定，且来源于昆虫的抗菌肽就有200多种。由于抗菌肽一般都具有抗细菌的活性，有的还具有抗病毒、抗原虫及抑制和杀伤肿瘤细胞等活性，并且具有热稳定性好、对正常细胞没有损害、不易产生耐药性等特点，已成为人们关注的热点。

家蝇能够在恶劣的环境中生存，在其长期抵御微生物的侵袭中形成了独特的免疫系统，人们对于家蝇抗菌肽的研究越来越多，其中研究较详细的有attacin、defensin、cecropin，而对双翅肽diptericin的研究较少。从昆虫体内提取天然抗菌肽的得率少，生产成本高，因此，构建基因工程菌来实现抗菌肽的高效表达成为人们研究的热点。本研究从家蝇幼虫体内克隆得到diptericin基因，与pGEX-4T-1载体连接后，在大肠杆菌BL21中进行表达，旨为后续筛选可以高效表达diptericin蛋白的基因工程菌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 家蝇 Musca domestica 种蝇由河南省疾病预防控制中心惠赠，幼虫由本实验室饲养，饲养温度25℃，相对湿度50%-70%；大肠杆菌DH5α、BL21购自天根生物生化科技有限公司，克隆质粒pMD19-T购自宝生物工程有限公司；大肠杆菌ATCC-25922和表达质粒pGEX-4T-1由本实验室保存。

1.1.2 试剂 GSTrap HP，1 mL购自GE Healthcare Life Sciences，RNAiso Plus、M-MLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、蛋白质分子量标准、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和DNA Marker为TaKaRa公司产品，质粒提取和DNA纯化回收试剂盒购自天根生物科技有限公司，其它试剂为国产和进口分析纯。PCR引物合成及DNA序列测定由上海生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 家蝇幼虫总RNA的提取 微生物刺激家蝇：培养大肠杆菌ATCC-25922至OD600=0.6-0.8，离心收集菌体，用生理盐水洗涤两次后重悬，最终OD600=1.8-2.0。选取大小均一、活动能力强的家蝇3日龄幼虫，用带有大肠杆菌的针刺破家蝇幼虫后1/3，饲养6 h后收集幼虫于液氮保存。总RNA提取：将幼虫于液氮研磨后，加入RNAiso Plus，提取总RNA（具体步骤按照RNAiso Plus试剂盒说明书），用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并测定RNA浓度及纯度。

1.2.2 RT-PCR克隆家蝇抗菌肽diptericin基因 从GenBank中查到家蝇diptericin基因mRNA序列（GenBank ID：FJ795370.1），在其编码区设计引物，上游引物引入EcoRⅠ酶切位点，下游引物引入XhoⅠ酶切位点（下划线），并加入27个碱基的HA标签序列（斜体）。

P1：5'-TTAGAATTCAACAAAATGAAATATCTC TGGGCCATTGTTC-3'；P2：5'-TATCTCGAGTCAAGCG TAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACCATCTGTAGGTAT AAC-3'。

以提取的总RNA为模板，用随机引物进行反转录合成cDNA第一链，反转录过程严格参照M-MLV反转录酶1st-strand cDNA合成的操作方法。以cDNA为模板，P1、P2为引物，扩增家蝇diptericin基因。PCR产物经纯化回收后，在T4 DNA连接酶作用下与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，利用蓝白斑筛选方法筛选阳性克隆，具体方法参照《分子克隆实验指南》［3］第15章。挑选阳性克隆进行菌落PCR鉴定、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，鉴定后的阳性克隆送至上海生工生物技术有限公司测序。

1.2.3 pGEX-4T-1-diptericin重组表达质粒的构建 将重组克隆pMD19-T-diptericin质粒和表达载体质粒pGEX-4T-1同时进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，并纯化回收diptericin基因和pGEX-4T-1质粒，回收产物经T4 DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌BL21，利用转化子的Amp抗性在LB平板上进行筛选，阳性克隆进行质粒PCR鉴定及双酶切鉴定，并进行测序，确定有正确的阅读框，无碱基突变后进行下步实验。

1.2.4 diptericin基因的融合表达 从平板上挑取pGEX-4T-1-diptericin-BL21的单克隆菌落，接种于3 mL含有Amp的LB培养基中，37℃培养过夜，第2天按照1∶100接种于100 mL LB培养基中，培养至OD600=0.6-0.8，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导4 h。离心收集菌体，在冰上进行超声破碎，条件：300 W，超声4 s，间隔4 s，10 min。破碎之后离心收集上清液。将上清液与等体积的2×SDS上样缓冲液混合，沸水浴3-5 min，取8 μL进行SDS-PAGE电泳检测，以转化有空质粒pGEX-4T-1的大肠杆菌BL21为对照。SDS-PAGE蛋白电泳参照《分子克隆实验指南》第5章，蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色，使用的分离胶浓度为12%。

1.2.5 Western-blot检测 目的蛋白中引入了HA标签，用此标签进行Western-blot检测目的蛋白，一抗：小鼠源 Anti-HA antibody，二抗：荧光素标记羊抗鼠IgG。经过SDS-PAGE电泳后，去除浓缩胶，按照分离胶尺寸剪好滤纸和硝酸纤维素膜（NC膜），并将其与电转移装置配套的海绵垫置于转移缓冲液平衡10 min。安装好电转移装置后，冰浴条件下3 W转移110 min。将NC膜用封闭液封闭2 h，一抗在室温下孵育1-2 h，二抗室温孵育1 h，用Odessey荧光WB检测系统扫描图片。

1.2.6 diptericin-GST融合蛋白的纯化 将重组pGEX-4T-1-diptericin-BL21大肠杆菌诱导表达后，离心取菌体沉淀进行超声破碎，取上清液用0.45 μm的过滤器进行过滤。按照GSTrap HP 1 mL纯化柱操作方法进行纯化，并进行SDS-PAGE电泳检测。

2 结果

2.1 家蝇幼虫总RNA的提取与RT-PCR扩增diptericin基因

本实验用RNAiso Plus试剂提取家蝇幼虫总RNA，经电泳检测条带清晰完整性好，OD260/OD280在1.8-2.0之间纯度好，为后续实验顺利进行奠定了基础。RT-PCR扩增diptericin基因，结果（图1）显示，扩增产物大小在350 bp左右，与预计的结果相符。

图1 RT-PCR扩增diptericin基因

2.2 重组菌pGEX-4T-1-diptericin-BL21的鉴定

提取阳性克隆质粒，进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，出现了大小约为4.9 kb和350 bp的两条带，表明重组质粒pGEX-4T-1-diptericin构建成功（图2）。将通过鉴定的质粒送至上海生物技术服务有限公司测序，分析测序结果，选取插入方向正确，具有正确的阅读框，无碱基突变的重组菌。测序结果显示，含有酶切位点及HA标签序列的diptericin基因长为345 bp，diptericin基因与GenBank中已公布diptericin序列的同源性最高达到99.9%，对其编码蛋白进行分析，diptericin基因编码99个氨基酸，分子量约为10.796 kD。

图2 重组质粒pGEX-4T-1-diptericin双酶切鉴定

2.3 家蝇diptericin融合蛋白诱导表达及检测

挑选重组pGEX-4T-1-diptericin-BL21的单菌落进行诱导表达，细胞破碎后提取上清，经过SDSPAGE电泳，同时将大肠杆菌BL21和含有空质粒的大肠杆菌pGEX-4T-1-BL21作为对照，结果（图3）显示，目的蛋白为带有GST标签的diptericin蛋白，约为37 kD，与理论大小相符，而对照组此位置均无条带，pGEX-4T-1-BL21经诱导后在大小约为26 kD处有明显条带，应为GST标签蛋白条带。

图3 重组diptericin基因表达产物SDS-PAGE电泳

2.4 Western-blot检测

通过HA抗体进行Western-blot检测，结果（图4）显示，pGEX-4T-1-diptericin-BL21诱导后有单一条带的目的蛋白，而对照组pGEX-4T-1-BL21无条带，表明diptericin基因成功在大肠杆菌BL21中得到了表达。

图4 重组diptericin蛋白Western-blot检测

2.5 重组蛋白纯化

收集pGEX-4T-1-diptericin-BL21诱导表达后的菌体超声破碎上清，通过GSTrap HP 1 mL纯化柱纯化目的蛋白，将洗脱缓冲液洗脱后的样品进行SDSPAGE电泳检测，结果（图5）显示，通过GST纯化柱纯化到了目的蛋白，显示为单一条带，大小约为37 kD。

图5 重组diptericin蛋白的纯化

3 讨论

已有许多学者对构建基因工程菌来生产抗菌肽进行了研究，包括原核表达和真核表达，如Liang等［4］利用将家蝇Cecropin基因克隆到pGEX-4T-1载体上，实现了其在大肠杆菌中的融合表达，切除GST标签后的Cecropin蛋白对大肠杆菌具有一定的抑菌效果，李小波等［5］将家蝇抗菌肽attacin克隆至酵母表达载体pPIC9K中，实现其在毕赤酵母GS115中的表达。双翅肽（diptericin）最早由Dimarcq等［6］从经细菌诱导的新陆原伏蝇Phormia terranovae幼虫的血淋巴中分离得到，并证实其参与昆虫的体液免疫防御且发挥着十分重要作用。然而，对于家蝇diptericin基因的研究并不多。

抗菌肽对蛋白酶非常敏感，而且表达抗菌肽对宿主菌可能具有毒性或者表达的抗菌肽无活性［7］，以融合蛋白的形式表达抗菌肽目的基因，可以减少抗菌肽本身对宿主菌的毒害作用，同时还能保护抗菌肽蛋白避免蛋白酶的降解［8］。pGEX-4T-1是目前较多使用的表达载体，它利用谷胱甘肽S-转移酶基因和目的基因连接，能够在大肠杆菌中产生GST融合蛋白，并且可以用凝血酶进行切割GST蛋白而获得目的基因产物。徐建华等［9］将家蝇Attacin基因分别克隆至原核表达载体pET30a（+）和pGEX-4T-1，转化大肠埃希菌，从pET30a（+）/Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白，而从pGEX-4T-1/Attacin重组质粒转化菌种获得了GST-Attacin融合蛋白。舒梅等［10］将水生动物抗菌肽Y18和CEC1分别克隆到pGEX-4T-1载体上，构建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1两个融合蛋白表达载体，获得了抗菌肽Y18和CEC1，并发现融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E.coli DH5α、S. aureus、B. subtilis和S. cerevisiae的生长。

本研究将家蝇diptericin基因克隆至pGEX-4T-1载体中，对重组大肠杆菌进行IPTG诱导，SDSPAGE蛋白电泳检测到大小约为37 kD的目的蛋白，Western-blot也检测到单一蛋白条带，说明diptericin基因在大肠杆菌中进行了融合表达。经过纯化，得到了含有GST标签的diptericin融合蛋白，以融合蛋白形式表达的diptericin蛋白对宿主菌没有明显的抑制生长作用，后续实验将通过切除GST标签来检测diptericin蛋白的生物活性，并通过研究不同诱导时间、温度等条件来改善目的基因的表达，以期筛选到可以高效表达diptericin蛋白的重组基因工程菌。

抗菌肽有不同的种类，通过将不同的抗菌肽串联进行表达有望得到活性更高的杂合抗菌肽，如陈玉海等［11］将非洲爪蟾皮肤分泌的两种抗菌肽magaininⅡ和PGLa在毕赤酵母中进行杂合表达，构建了杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa的分泌型毕赤酵母表达载体，实现了杂合抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达。因此，今后可将不同的家蝇抗菌肽基因进行串联表达，获得抗菌谱更广、活性更高的基因工程抗菌肽蛋白。

4 结论

本研究成功构建了家蝇diptericin基因原核表达载体pGEX-4T-1-diptericin-BL21，在大肠杆菌BL21中获得了该蛋白的可溶性表达，经过GST标签纯化柱纯化得到了diptericin蛋白。

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（责任编辑 马鑫）

Expression of diptericin Gene from Musca domestica in Escherichia coli

LU Min1，2BAI Jie1WEI Feng-xian1WANG Lin-yi1XU Bin1YIN Qing-qiang2LI Shao-yu1
（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002；2. College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002）

In order to efficiently acquire the antibacterial peptide by prokaryotic expression，diptericin gene for the antibacterial peptide in housefly was reversely synthesized by RT-PCR method. Then，diptericin gene was cloned to pGEX-4T-1 expression vector and transformed into Escherichia coli BL21 for protein expression. Sequencing result showed that housefly’s diptericin gene was 345 nucleotides in length. Recombinant pGEX-4T-1 was induced by IPTG，and the expression of diptericin fusion protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis and Western blot. The result showed that diptericin fusion protein with GST-tag was about 37 kD，and the target protein was purified by GST purification column.

housefly；antibacterial peptide；diptericin；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.020

2015-09-02

河南省科技攻关项目（142102110069），国家现代农业产业技术体系项目（CARS-42）

卢敏，女，博士研究生，研究方向：动物营养与饲料科学；E-mail：453808792@qq.com

李绍钰，男，研究员，研究方向：动物营养调控与饲料高效利用；E-mail：lsy9617@aliyun.com