孙翠红，徐翠莲，丁丽芳，王雪芬，李洪亮，付培培，陈发元，李宝宝，施守杰，赵铭钦

氨基寡糖素是指D－氨基葡萄糖以β－1，4－糖苷键连接的低聚糖天然产物，也称农业专用壳寡糖，是通过采用独特的生物技术进一步降解甲壳素或壳聚糖得到的［1］。作为一种新型糖类生物农药，不仅具有对非靶标生物毒性低、影响小，并在环境中易分解、无残留，同时还有用量小、安全性好的特点。该药剂可诱导提高植物的抗性，严凯等［2-5］研究表明，氨基寡糖素对烟草、辣椒、番茄作物上的病毒病(TMV，CMV等)具有较好的抑制作用。近年来，纳米银作为一种新型、绿色、高效的纳米材料在医药、食品、精细化工等领域备受关注。纳米银不仅具有强效的抗菌作用，还具有抗病毒、抗肿瘤等生物活性［6-11］。作者以壳寡糖为还原剂和稳定剂得到了壳寡糖纳米银溶液(COS-Ag)。壳寡糖纳米银的抗病毒活性也已有报道，对人体 H1N1，HCMV等具有显著的抑制作用［12-13］。烟草花叶病在中国大多数烟区发生严重，降低了烟叶产量和品质，无法满足卷烟行业对优质烤烟的要求。目前，还没有专门有效地针对烟草花叶病的农药，农业上常用的预防药剂为宁南霉素水剂或者氨基寡糖素水剂。本研究将天然生物药剂壳寡糖与银离子结合制得了壳寡糖纳米银药剂，有效地将二者的抗病性结合在一起在田间进行抗烟草花叶病的试验，旨在为新的抗病毒药剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试品种、药剂

供试品种为豫烟10号。供试药剂为0.5%的氨基寡糖素水剂，河北奥德植保药业有限公司;壳寡糖(COS，相对分子质量平均为5 000)，上海国药集团化学试剂有限公司;硝酸银(AgNO3)，分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心。仪器有CL－2型恒温加热磁力搅拌器，郑州国瑞科技仪器有限公司;TU－1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 壳寡糖纳米银溶液(COS-Ag)的制备

将50 mL 1 g·L－1壳寡糖溶液加入100 mL烧杯中，然后再向其中加入5 mL 10 g·L－1的硝酸银溶液，在80℃条件下搅拌70 min，得到壳寡糖纳米银溶液(COS-Ag)。

1.3 试验地点

试验设在河南省许昌市许昌县烟草试验田。该地连续3 a以上种植烟草，烟草花叶病常年比较严重。试验地地势平坦、灌溉方便、土质较好、肥力均匀一致，土壤质地为壤土。移栽期为2014－05－10，种植行距120 cm，株距50 cm。试验共设3个处理:A、稀释700倍的氨基寡糖素;B、质量浓度为10 mg·L－1的 COS-Ag溶液;C、清水(对照)。每个处理(小区)面积667 m2，随机分组进行试验设计，重复3次，四周设保护行。烟田日常施肥、病虫害防治、除草、灌溉等均与大田管理一致。

1.4 试验设计

烟田预防试验:选择无发病的烟田进行药剂预防试验，在移栽后30 d开始进行喷药，连续喷药3次，每次间隔10 d，喷药前对烟田进行普查，没有发现病株。

烟田治疗试验:于2014－06－28，2014－07－05，2014－07－12进行喷药。2014－06－17进行烟田普查，发现零星烟草普通花叶病烟株。

在3次喷药后每5～7 d时间观察记载发病情况。根据《烟草侵染性调查分级标准》，调查病斑的变化情况，计算病情指数、发病率和防治效果，并记录发病时间。选取治疗试验的烤后样C3F为研究对象，研究不同处理烟叶常规化学成分和中性香味物质的含量。

1.5 病情指数的调查和分级标准

烟草花叶病分级标准如下［14］:

0级:全株无病。

1级:心叶脉明或轻微花叶，或上部不超过1/3叶片花叶，或有病斑，但不变形，植株无明显矮化。

2级:1/3～2/3叶片花叶或少数叶片变形或主脉变黑，植株矮化为正常株高的2/3以上。

3级:1/2～2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2～2/3。

4级:全株叶片花叶或严重变形或坏死，病株矮化为正常株高的1/3～1/2，30%以上叶脉坏死，病株较健株矮1/3以上。

1.6 烤后样常规化学成分和中性香味物质的测定

烤烟常规化学成分的测定参考文献［15］的方法进行;中性香味物质的提取选用水蒸气蒸馏－二氯甲烷溶剂同时蒸馏萃取法，采用内标法定量，由GC/MS测定结果和NIST02库检索定性［16］。

2 结果与分析

2.1 氨基寡糖素和壳寡糖纳米银溶液对烟草花叶病毒的预防效果

各个药剂处理对感染烟草花叶病毒烟株的预防效果见表1。由表1可以看出，氨基寡糖素处理和COS-Ag与对照清水相比，对感病烟株均有较好的抑制作用，各个处理下平均病情指数分别为11.45，8.65 和 20.40，与对照相比，氨基寡糖素处理和COS-Ag处理下平均病情指数分别比对照43.87%，57.60%，氨基寡糖素处理和 COS-Ag处理与对照之间的病情指数存在着显著性和极显著性差异;各个时期下COS-Ag处理的烟株发病率较高，而由预防效果可以看出，不同的调查时期下COS-Ag处理对感染烟草花叶病毒的烟株的防治效果均优于氨基寡糖素处理，其中COS-Ag处理下的最大防治效果可达到67.74%，且以56.81%平均预防效果高出氨基寡糖素处理(平均预防效果为43.52%)。

表1 氨基寡糖素和壳寡糖纳米银溶液对烟草花叶病毒病的预防效果Table 1 The prevention effect of COS and COS-Ag on tobacco mosaic

2.2 氨基寡糖素和壳寡糖纳米银溶液对烟草花叶病毒的治疗效果

各个药剂处理对感染烟草花叶病毒烟株的治疗效果见表2。由表2可以看出，氨基寡糖素和COS-Ag与对照清水相比，对感病烟株均有较好的抑制作用。各个时期，烟草花叶病的发病率以COS-Ag处理下较低;对照处理的病情指数平均为17.51，氨基寡糖素处理下病情指数平均为13.25，对大田感染烟草花叶病的烟株的抑制率提高了24.32%。COS-Ag处理下的平均病情指数为10.98，与对照相比，对病株的抑制率提高了37.29%，氨基寡糖素处理和COS-Ag处理与对照之间的病情指数存在着显著性和极显著性差异;由治疗效果可以看出，不同调查时期的COS-Ag处理对感染烟草花叶病毒的烟株的治疗效果均优于氨基寡糖素处理，COS-Ag处理下最大治疗效果可达43.63%，其平均治疗效果比氨基寡糖素处理高出12.97%。

表2 氨基寡糖素和壳寡糖纳米银溶液对烟草花叶病毒病的治疗效果Table 2 The treatment effect of COS and COS-Ag on tobacco mosaic

2.3 氨基寡糖素和壳寡糖纳米银溶液对感病烟株常规化学成分的影响

不同药剂处理下烟叶常规化学成分如表3所示，由表3可见，各个处理条件下烤烟总糖和还原糖含量均偏高。相对来说，以COS-Ag处理下总糖含量较接近于工业要求的总糖和还原糖含量的范围，为2.639，2.466 g·kg－1;各处理烟碱、总氮和钾氯比均符合卷烟企业的要求，其中以COS-Ag处理的含量较接近于优质烟的要求，这可能与COSAg处理感病烟株的病情状况得到有效缓解有关。

表3 氨基寡糖素和壳寡糖纳米银溶液对烤烟常规化学成分的影响Table 3 Effect of COS and COS-Ag on routine chemical compositions in flue-cured tobacco

2.4 氨基寡糖素和壳寡糖纳米银溶液对感病烟株烤后中性致香成分的影响

不同药剂处理的烤烟中性致香物质的种类相同，但含量存在着差别(表4)。中性致香物质按香味前体物可分为5类，分别为类胡萝卜素降解产物、类西柏烷类降解产物、叶绿素降解产物、芳香族氨基酸降解产物和美拉德反应产物(表4、表5)。COS-Ag处理的类胡萝卜素降解产物中的香叶基丙酮和巨豆三烯酮3，芳香族氨基酸降解产物中的苯乙醛，美拉德反应产物中的糠醛、6－甲基－5－庚烯－2－醇和3，4－二甲基－2，5－呋喃二酮的含量低于氨基寡糖素处理，其他大多数香味物质含量为最高。

由表5可以看出，COS-Ag处理条件下，除了芳香族氨基酸降解产物和美拉德反应产物略低于氨基寡糖素处理，其他致香成分均高于其他2个处理，各个处理下烤烟中性致香成分的总量分别为773.70，923.02 和 581.08 μg·g－1。与对照相比，COS-Ag处理和氨基寡糖素处理均达到了显著性或极显著性差异。

表4 氨基寡糖素和壳寡糖纳米银溶液对烤烟中性致香成分的影响Table 4 Effect of COS and COS-Ag on neutral aroma component in flue-cured tobacco μg·g－1

表5 不同处理的各类中性致香成分含量Table 5 The content of five neutral aroma component in different treatment μg·g

3 结论与讨论

与氨基寡糖素水剂相比，COS-Ag对大田感染烟草花叶病的烟株具有较好的预防和治疗效果，其最大防治效果分别达到67.74%，43.63%，这比已有报道［17-19］的数据有显著提高，其中原因可能与壳寡糖自身的诱导抗病性有关，有可能与纳米银的诱导抗病性有关，或者与二者的协同作用有关。

COS-Ag处理下可有效改善烟叶的品质，常规化学成分对卷烟风格的形成有着重要的影响，烟叶中各个致香物质对烟叶品质的形成有着重要的影响。COS-Ag处理下烟叶常规化学成分处于较适宜的范围，类胡萝卜素类降解产物和类西柏烷类降解产物等重要的致香成分含量较高，且与对照相比差异性显著。本研究表明，COS-Ag在诱导烟株抗烟草花叶病方面具有潜在的应用前景，这不仅为壳寡糖衍生物纳米银的深入研究和开发利用提供依据，也为新型、绿色、高效农药的开发提供了很大的发展空间。

［1］ 冯自力，朱荷琴，李志芳，等.氨基寡糖素水剂对棉花黄萎病的防治效果及其使用技术［J］.中国棉花，2014，41(7):11 －13.

［2］ 严凯，宋宝安，杨松，等.0.5%氨基寡糖素AS对烟草TMV的抑制及作用机理的初步研究［J］.农药，2007，46(4):280－282.

［3］ 苏小记，王亚红，贾丽娜，等.氨基寡糖素对番茄主要病害的防治作用［J］.西北农业学报，2004，13(2):79－82.

［4］ 赵小明，杜昱光，白雪芳.氨基寡糖素诱导作物抗病毒药效试验［J］.中国农学通报，2004，20(4):245－247.

［5］ 余清，刘勇，莫笑晗，等.氨基寡糖素在烟草上的应用［J］.中国生物防治，2002，18(3):128 －131.

［6］ LI W R，XIE X B，SHI Q S，et al.Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles on Escherichia coli［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2010，85:1115－1122.

［7］ HERNANDEZ-SIERRA J F，RUIZ F，PENA D C C，et al.The antimicrobial sensitivity of streptococcus mutans to nanoparticles of silver，zinc oxide，and gold［J］.Nanomedicine Nanotechnology Biology ＆ Medicine，2008，4(3):237－240.

［8］ SUN R W，CHEN R，CHUNG N P，et al.Silver nanoparticles fabricated in hepes buffer exhibit，cytoprotective activities toward HIV-1 infected cells［J］.Chemical Communications，2005，40(40):5059 －5061.

［9］ LU L，SUN R W，CHEN R，et al.Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication［J］.Antiviral Therapy，2008，13(2):253 －262.

［10］ YOUNGS W J，ROBISHAW N，PANZNER M J.Treatment of breast cancer with silver antitumor drugs encapsulated in biodegradable polymeric nanoparticles［J］.Nanotech Conference ＆ Expo，2009，2:5 －8.

［11］ HITOSHI O，MAK T W.Pathways of apoptotic and nonapoptotic death in tumour cells［J］.Nature Reviews Cancer，2004，4(8):592 － 603.

［12］ MORI Y，ONO T，MIYAHIRA Y，et al.Antiviral activity of silver nanoparticle/chitosan composites against H1N1 influenza A virus［J］.Nanoscale Research Letters，2013，8(8):1 －6.

［13］ RUSSO E，GAGLIANONE N，BALDASSARI S，et al.Preparation，characterization and in vitro antiviral activity evaluation of foscarnet-chitosan nanoparticles［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2014，118(2):117－125.

［14］杜林洳，王莹，徐翠莲，等.河南省宝丰襄城两地烟草花叶病田间防效试验［J］.广西农学报，2015，30(2):30－32.

［15］王瑞新，韩富根.烟草化学品质分析法［M］.郑州:河南科学技术出版社，1990.

［16］史宏志，邱慧慧，赵晓丹，等.豫中烤烟烟碱和总氮含量与中性香气成分含量的关系［J］.作物学报，2009，35(7):1299－1305.

［17］张琼芬.几种病毒抑制剂对烟草花叶病防效试验［J］.江西农业学报，2011，23(7):141 －142.

［18］雷吕英.防治烟草花叶病的药剂试验［J］.中国烟草科学，2002，1(1):28 －29.

［19］喻大招，周忠泉，杨振荣，等.病毒抑制剂防治烟草花叶病田间试验［J］.烟草科技，2003(8):46 －48.